Skip to content

Spontaniczne zapalenie nerwu wzrokowo-kręgowego mózgu w modelu transgenicznego mysiej autoimmunizacji komórek T / komórek B ad 8

1 miesiąc ago

606 words

Subpopulacje limfocytów oczyszczono ze śledzion myszy transgenicznych za pomocą zestawów do selekcji negatywnych komórek B lub komórek T (Dynal). Ich żywotność i czystość oceniono za pomocą analizy FACS. Procedura oczyszczania komórek generalnie powodowała populacje komórek, które były czyste w ponad 90%. Oznaczanie limfocytów przez CFSE. Komórki (2 x 107) inkubowano w 37 ° C przez 10 minut z 1% FCS / PBS zawierającym 5. M CFSE (Invitrogen), a następnie intensywnie przemyto zimnym PBS. ELISA. Komórki wysiano i stymulowano jak opisano dla testów proliferacji. Po 72 godzinach zebrano supernatanty komórkowe. Stężenia cytokin określano stosując dopasowane pary przeciwciał dla mysiej IL-2, IFN-a, IL-4, IL-5 (BD Biosciences. Pharmingen) i IL-17 (R & D Systems). Do oznaczenia cytometrii kolorymetrycznej jako substrat użyto kwasu 2,2-azino-bis (3-etylo-benzotiazolino-6-sulfonowego (ABTS, Sigma-Aldrich), a płytki odczytano przy 405 nm. Przeciwciała specyficzne względem MOG Seryjnie rozcieńczoną surowicę pobraną od transgenicznych myszy przeniesiono na 96-studzienkowe płytki do ELISA (Nunc) wstępnie powleczone rMOG Po intensywnym przemyciu, związaną Ig wykrywano przez kanapkę składającą się z biotynylowanego allotypu i specyficznego dla izotypu przeciwciała. mysie Ig (wszystkie BD Biosciences . Pharmingen, patrz dodatkowe metody dla szczegółów) i kompleks streptawidyna-HRP (BD Biosciences Pharming) ABTS zastosowano jako barwny substrat, który zmierzono przy 405 nm Ilościowa analiza PCR TaqMan w czasie rzeczywistym. Całkowity RNA wyizolowano z rdzenia kręgowego i nerwów wzrokowych metodą ekstrakcji TRI Reagent (Sigma-Aldrich), a po traktowaniu DNase I przekształcono w cDNA przy użyciu starterów heksanukleotydowych lub oligo-dT i odwrotnej transkryptazy SuperScript II (Invitrogen). Startery se i antysensowne w połączeniu z sondami FAM / TAMRA TaqMan i primery specyficzne dla genu (syntetyzowane w Metabion) zostały użyte do analizy PCR. Wykaz zastosowanych sekwencji starterów dla genów IFN-a, TNF-a, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IP-10, eotaksyny, Foxp3 i GAPDH przedstawiono w Suplemental Methods. Tam, gdzie to możliwe kombinacje sekwencji starterów / sond obejmowały sekwencje kontaktowe kolejnych egzonów. Do amplifikacji zastosowano mieszaninę ABsolute QPCR (ABgene). Każdą reakcję przeprowadzono trzykrotnie na maszynie ABI 5700 (Applied Biosystems) i znormalizowano do transkryptów GAPDH genu CDT. Dane pierwotne analizowano za pomocą oprogramowania GeneAmp SDS 5700 (Applied Biosystems). Statystyka. Opisową analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Excel 2003 (Microsoft) i Prism w wersji 4 (GraphPad). Różnicową zachorowalność EAE analizowano za pomocą testu log-rank (za pomocą wbudowanej analizy krzywych przeżycia z Prism, wersja 4). Wartości P mniejsze niż 0,05 uznano za znaczące. Materiały dodatkowe Zobacz Dodatkowe dane Podziękowania Dziękujemy Irene Arnold-Ammer za wyjątkową pomoc techniczną; Edgar Meinl, Florian Kurschus i Klaus Dornmair za krytyczną recenzję manuskryptu; Estelle Bettelli i Vijay Kuchroo za dostarczanie myszy transgenicznych 2D2; Danielle Pham-Dinh dla MOG. /. Zwierząt; i Shimon Sakaguchi dla hybrydom DTA-1 i PC61. Praca ta była częściowo wspierana przez społeczeństwo Max Planck, Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 571) i National Multiple Sclerosis Society (grant RG3335A1 / T). Przypisy Niestandardowe skróty: FACS, sortowanie komórek aktywowane fluorescencyjnie; Myszy IgHMOG, specyficzne dla MOG myszy z knock-inem łańcucha ciężkiego Ig na tle C57BL / 6; MBP, podstawowe białko mieliny; MOG, glikoproteina oligodendrocytów mieliny; OSE, optyczno-rdzeniowy EAE; rMOG, rekombinowany MOG aa1-125; SPF, wolny od patogenu; Myszy TCRMOG, myszy transgeniczne TCR specyficzne dla MOG na podłożu C57BL / 6; Myszy TCROVA, myszy transgeniczne specyficzne dla OVA TCR na podłożu C57BL / 6. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J. Clin. Invest.116: 2385. 2392 (2006). doi: 10.1172 / JCI28330. Obecny adres Andreasa Holza to: Technical University of Braunschweig. Biocentrum, Wydział Komórki i Biologii Molekularnej, Braunschweig, Niemcy. Zobacz powiązany komentarz zaczynający się na stronie 2313.
[podobne: biustonosze na duzy biust, biedronka świątniki górne, mozga kanaryjska gdzie kupić ]
[przypisy: mozga kanaryjska gdzie kupić, nfz poznań piekary godziny otwarcia, sanatoria nad morzem nfz ]