Skip to content

Zmniejszenie dystrofii mięśniowej u myszy poprzez nadekspresję SERCA w mięśniach szkieletowych ad 7

2 miesiące ago

769 words

Sarcolipin to małe białko błonowe SR, które hamuje aktywność SERCA1. Rzeczywiście, Campanaro i in. również odnotowali podobny wzrost ekspresji mRNA sarcolipiny w mięśniu uzyskanym od pacjentów z dysferlinopatią (39). Bardzo interesujące jest również to, że mięśnie oszczędzone w chorobie u myszy mdx, mięśnie krtani, wykazują znaczną nadekspresję SERCA1 z chorobą (40). Niedawno, w bezpośrednim poparciu naszego badania wykazano, że przeniesienie genu AAV-SERCA1a u myszy mdx powoduje zmniejszenie centralnie położonych jąder w przeponie i zmniejszenie uszkodzenia wywołanego skurczem ekscentrycznym (41). Badanie to było szczególnie interesujące, ponieważ korzystny efekt terapii wirusowej trwał do 6 miesiąca życia, co sugeruje, że takie podejście może zapewnić długotrwałą ochronę u ludzi (41). W naszych rękach bezpośrednia iniekcja AAV9-SERCA2a w mięśniu brzuchatym łydki dała zadziwiającą ochronę przed chorobą dystroficzną w Sgcd. /. myszy (Figura 8), ponownie sugerując całkowicie nowe podejście do terapii genowej u ludzi z MD. Podejścia eksperymentalne omówione powyżej zasugerowały hipotezę, że zwiększone usuwanie Ca2 + bezpośrednio chroni przed MD. Jeśli Ca2 + naprawdę jest. Ostatnią wspólną ścieżką. w przypadku nekrozy mio włóknistej poniżej większości mutacji genetycznych, które indukują MD, uniwersalna terapia może z łatwością obejmować podejścia, które zwiększają klirens Ca2 + w cytozolu. W tym przypadku wykorzystaliśmy nadekspresję SERCA1 w celu zwiększenia szybkości wychwytu zwrotnego Ca2 + w SR w celu możliwie zmniejszenia efektów związanych z przewlekłym wyciekiem Ca2 + z aktywowanych kanałów i pęknięć błony. W niewydolności serca obserwowano podobny defekt w stabilności błony i postępowaniu z Ca2 +, co wskazuje na postępującą śmierć komórek i nasilenie choroby (42, 43). W tym kontekście nadekspresja SERCA2 przez transgenezę lub strategie terapeutyczne genów lub odhamowanie endogennego SERCA2 przez delecję fosfolambanu, drastycznie chroniły myszy przed niewydolnością serca. Rzeczywiście, wyniki ostatniej próby terapii genowej u pacjentów z niewydolnością serca z AAV-SERCA2a były skuteczne (44). Tak więc strategia terapii genowej z SERCA1 / 2 AAV może reprezentować. podejście do łagodzenia MD w związku z wieloma typami mutacji genów poprzez korygowanie ostatecznej wspólnej wady w postępowaniu z Ca2 +, która wydaje się leżeć u podstaw większości postaci MD. Metody Zwierzęta. Zmodyfikowany ludzki szkieletowy promotor p-aktyniny (podarunek od Edna C. Hardeman, University of Sydney, Sydney, Australia) został użyty do stworzenia myszy Tg nadekspresjonujących izoformę SERCA1 szczura mięśni szkieletowych (dostarczoną przez Muthu Periasamy, The Ohio State University, Columbus, Ohio, USA). Wygenerowano 12 linii Tg, z których 2 linie analizowano pod kątem eksperymentów. Sgcd. /. i myszy TRPC3 Tg opisano wcześniej (10, 24). Wykorzystanie zwierząt w tym badaniu zostało zatwierdzone przez IACUC w Szpitalu Dziecięcym w Cincinnati. Izolacja mitochondrialna i test obrzękowy. Mitochondria z tylnych kończyn mięśni szkieletowych dorosłych izolowano jak opisano wcześniej (45). Pokrótce, myszy uśmiercono i tylną kończynę mięśni szkieletowych usunięto, zmielono i umieszczono w buforze do homogenizacji uzupełnionym trypsyną mg / ml, mieszano przez 30 minut w 4 ° C, i przemyto i homogenizowano w homogenizatorze ze szklanym teflonem. Ekstrakt mięśniowy poddano następnie wirowaniu różnicowemu w celu wyizolowania mitochondriów. Rozproszenie światła mierzono stosując 250 .g mitochondriów zawieszonych w ml buforu i do wywoływania pęcznienia mitochondrialnego i kurczenia stosowano 200 .M CaCl2 lub 5% PEG (w / v). Zmieniano absorbancję przy 540 nm co 10 sekund przez maksymalnie 10 minut. Western blotting. Mięśnie izolowano i przygotowano ekstrakty przez homogenizację w buforze do lizy, zawierającym 50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl i mM EDTA. Ekstrakty odwirowano przy 13 000 gw ciągu 10 minut, a 5. 25. G białka rozdzielono na żelu SDS. 8% żele poliakryloamidowe do analizy Western blot i chemiluminescencyjnej (Amersham Bioscience). SERCA1 wykrywano stosując mysie przeciwciało monoklonalne (1: 2500) z Affore Bioreagents. Analiza histologiczna. Mięśnie były zatopione w parafinie, a skrawki histologiczne 7. M wycinano w centrum mięśnia i barwiono za pomocą trichromu H & E lub Massona. Śródmiąższowe obszary włókniste zostały określone ilościowo za pomocą analizy metamorficznej procentu obszaru niebieskiego w sekcjach trichromowych Massona. Test aktywności Calpain. Aktywność kalpainy z mięsień czworogłowy oceniano za pomocą protokołu zalecanego przez producenta (Abcam). W skrócie, mięśnie poddano lizie w buforze ekstrakcyjnym i wirowano przy 20 817 g, aby wytworzyć supernatant do analizy
[hasła pokrewne: polipy woreczka żółciowego, sezam właściwości lecznicze, sanatoria nad morzem nfz ]
[więcej w: dieta montignaca przepisy, ciśnienie atmosferyczne a samopoczucie, biedronka świątniki górne ]