Skip to content

Inhibitor szlaku czynnika tkankowego-2 jest nowym inhibitorem metaloproteinaz macierzy zewnątrzmacicznej mającym wpływ na miażdżycę czesc 4

2 miesiące ago

694 words

Wytrącone osady i oryginalne supernatanty rozdzielono metodą SDS-PAGE i zastosowano do analizy zymograficznej lub analizy Western blot. Do analizy zymograficznej żele przemywano dwukrotnie (15 minut) 2,5% Tritonem X-100 i inkubowano (24 godziny, 37 ° C) w buforze zymograficznym (50 mM Tris HCl, 10 mM CaCl2, 50 mM NaCl, 0,05% BRIJ 35 ). Żele zabarwiono stosując Coomassie Brilliant Blue R-250 (Sigma Chemical Co.). Przezroczyste obszary na żelu barwionym Coomassie wskazały miejsca żelatynolizy. Immunohistochemia. Płytki miażdżycowe z ludzkich tętnic wieńcowych i szyjnych (n = 12) i tętnic bez miażdżycy (n = 5) uzyskano od dawców przeszczepów, przy endarterektomii i podczas autopsji. Wysuszone na powietrzu seryjne sekcje kriostatu (6 .m) utrwalono w acetonie (5 minut, w 20 ° C), wstępnie inkubowano z PBS / 0,3% H2O2 i inkubowano (30 minut) z pierwotnym lub kontrolnym Ab (mysi białko szpiczaka MOPC- 21, Sigma Chemical Co. lub królicze IgG). Późniejsza obróbka została przeprowadzona zgodnie z zaleceniami producenta (uniwersalny zestaw peroksydazy DAKO LSAB, DAKO Corp., Carpinteria, Kalifornia, USA). Wiązanie Ab wizualizowano za pomocą 3-amino-9-etylo-karbazolu (AEC, Sigma Chemical Co.). W celu kolokalizacji TFPI-2 odpowiednimi typami komórek lub MMP, przeprowadzono barwienie podwójnie immunofluorescencyjne. Zamrożone skrawki inkubowano z króliczym antyludzkim TFPI-2 Ab (90 minut), a następnie biotynylowanym wtórnym kozim anty-króliczym Ab (45 minut, Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornia, USA) i streptawidyną sprzężoną z czerwienią Texas (30 minut; Amersham Pharmacia Biotech Inc.). Następnie próbki potraktowano zestawem blokującym avidyna-biotyna (Vector Laboratories), przepłukano i wybarwiono Abs specyficzny dla komórek monoklonalnych lub MMP (24 godziny, 4 ° C), biotynylowany drugorzędny koński anty-mysie Ab, i na koniec sprzężoną z FITC streptawidynę (30 minut) (Amersham Pharmacia Biotech Inc.). Jądra barwiono na niebiesko za pomocą bisbenzimidu (Calbiochem-Novabiochem Corp.). Wyniki TFPI-2 hamuje aktywność MMP. W celu określenia, czy TFPI-2 bezpośrednio hamuje aktywność MMP, zmienne stężenia ludzkiego rekombinowanego TFPI-2 wstępnie inkubowano z aktywowanym rekombinowanym MMP-1 (1 godzina, 37 ° C) przed dodaniem substratu kolagenowego ze sprzężonym fluoroforem typu I. Stężenie TFPI-2 w sposób zależny hamowało zależną od MMP-1 (3 (10 ug / ml, odpowiadającą 200 nM MMP-1) kolagenolizę (Figura 1a) z medianą skutecznej dawki (EC50) 1,6. 0,53 .g / ml, co odpowiada w przybliżeniu 57,6. 19,1 nM TFPI-2 (n = 10). Maksymalne hamowanie (85,9%. 0,23%, n = 10) obserwowano przy 9,6. 5,2 g / ml TFPI-2 (345. 187 nM). Ponieważ ostatnio dostarczyliśmy dowody na śródmiąższową kolagenolizę MMP-13 w obrębie ludzkiego miażdżycy (9), analizowaliśmy także wpływ TFPI-2 na tę MMP. TFPI-2 zmniejszyło aktywność MMP-13 (10 .g / ml) w sposób stechiometryczny podobny do obserwowanego dla MMP-1, osiągając podobne maksymalne hamowanie (Figura 1b) przy EC50 wynoszącym 0,876. 261 .g / ml, co odpowiada w przybliżeniu 31,5. 9,4 nM TFPI-2 (n = 4). TFPI-2 i TIMP-1 miały podobną stechiometrię hamującą (Figura 1, e i f). Pozostaje do ustalenia, czy niepełne hamowanie aktywności MMP przez TFPI-2 wynika z niewystarczającej zdolności inhibicyjnej lub z tła testowego, chociaż odkrycie, że TIMP-1 w tych samych testach dawało podobne maksymalne hamowanie, potwierdza to ostatnie wyjaśnienie. Zbadaliśmy dalej, czy TFPI-2 hamuje dalsze mediatory kolagenu. Serpin ten hamował żelatynazy MMP-2 i MMP-9 mniej skutecznie i silniej niż w przypadku kolagenazy śródmiąższowej (ryc. 1, c i d). Maksymalne hamowanie żelatynaz (10 .g / ml) wymagało 58,9. 17,1 .g / ml (2,1-0,6-M) i 63,4%. 20,0 .g / ml (2,3- 0,7 .M), obniżając aktywność MMP-2 do 40%. 14,6% (n = 6) i MMP-9 do 37%. 14,4% (n = 6). Mediana skutecznej koncentracji odpowiadała 15,3. 3,4 ng / ml (551. 122 nM) i 14,1. 4,8 ng / ml (508. 173 nM) TFPI-2 odpowiednio dla MMP-2 i MMP-9. Podobnie skuteczne hamowanie żelatynazy wymaga stosunku molowego 3: TIMP-1 / MMP (dane nie przedstawione). Eksperymenty kontrolne wykazały brak aktywności MMP-2 i MMP-9 w teście kolagenazowym (dane nie pokazane). Ponadto, nieaktywowane MMP-1 lub MMP-13 nie wykazywały aktywności żelatynolitycznej, eliminując możliwość, że inne enzymy, np. Proteinazy serynowe, mogą odpowiadać za aktywność degradującą ECM zapewnioną przez zastosowane preparaty MMP. Aktywowane APMA MMP-1 i MMP-13 wykazywały pewną aktywność żelatynolityczną, chociaż znacznie mniejszą niż MMP-2 lub MMP-9 (dane nie przedstawione). Ponadto, TFPI-1 nie wpływał na aktywność MMP, a sam TFPI-2 nie wpływał na intensywność fluorescencji ani gęstość optyczną w żadnym z zastosowanych testów (dane nie pokazane).
[przypisy: błonnik witalny gdzie kupić, jak naturalnie rozjaśnić włosy, biedronka świątniki górne ]
[patrz też: polipy woreczka żółciowego, na czym polega rezonans magnetyczny, błonnik witalny gdzie kupić ]