Skip to content

Inhibitor szlaku czynnika tkankowego-2 jest nowym inhibitorem metaloproteinaz macierzy zewnątrzmacicznej mającym wpływ na miażdżycę cd

2 miesiące ago

693 words

Czas wymagany do osiągnięcia równowagi (30 minut) określono postępując po hamowaniu po zmieszaniu MMP i TFPI-2. Następnie dodano odpowiedni substrat skoniugowany z FITC (25 ° C) i określono aktywność enzymatyczną podczas liniowej szybkości reakcji przez ciągłe monitorowanie za pomocą spektrofotometru fluorescencyjnego przy długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 495 nm i 515 nm. Wartości EC50 określono dla inkubacji każdej z odpowiednich MMP z TFPI-2. Reakcje wykorzystujące nieskoniugowany kolagen analizowano metodą Western blotting za pomocą kolagenu AB anty-I typu I. Aktywność hamującą TFPI-2 wobec katepsyn zbadano przez zastosowanie katepsyny S lub K (obydwa 10 .g / ml) do testów przetwórczych identycznych w procedurze z tymi opisanymi powyżej, z zastosowaniem kwasowego bufora do obróbki proteaz (0,05% Triton X-100, 20 mM octan sodu i mM EDTA, pH 5,5), jak opisano wcześniej (38). Procent aktywności MMP / katepsyny określono przez podzielenie intensywności fluorescencji próbki przez wartość uzyskaną przy identycznych stężeniach MMP bez TFPI-2. Dla celów kontrolnych, TFPI-2 preinkubowano (1 godzina, 37 ° C) z trypsyną (Sigma Chemical Co.) lub VIIa / TF (American Diagnostica Inc., Greenwich, Connecticut, USA) lub zastąpiono rekombinowanym TFPI-1. (American Diagnostica Inc.) lub TIMP-1. Dodatkowo zastosowano nieaktywowany termicznie TFPI-2 (10 minut, 95 ° C). Dane są przedstawione jako średnie. SD, otrzymany z podwójnych oznaczeń. Analiza Western blot. Próbki oddzielono standardową SDS-PAGE w warunkach nieredukujących i przeniesiono na membrany z difluorku poliwinylidenu (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, California, USA) stosując półsuchy aparat do blottingu (0,8 mA / cm2, 30 minut; Laboratories Inc.). Bloty zablokowano (> 2 godziny) w 5% odtłuszczonym mleku w proszku / PBS / 0,1% Tween-20. Po godzinie inkubacji z pierwszorzędowym Ab, bloty przemywano trzy razy (PBS / 0,1% Tween), a drugorzędny, skoniugowany z peroksydazą Ab (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania, USA) dodano przez kolejną godzinę. Na koniec bloty przemywano trzykrotnie (PBS / 0,1% Tween), a immunoreaktywne białka wizualizowano stosując wykrywanie chemiluminescencyjne metodą Western blot (NEN Life Science Products Inc., Boston, Massachusetts, USA). Izolacja i kultura komórek. Ludzkie naczyniowe SMC izolowano z żyły odpiszczelowej człowieka przez eksplantację odrastania i hodowano w DMEM (BioWhittaker Inc., Walkersville, Maryland, USA) uzupełnionym 1% L-glutaminą (BioWhittaker Inc.), 1% penicyliną / streptomycyną (BioWhittaker Inc. ) i 10% FBS (Atlanta Biologicals Inc., Norcross, Georgia, USA). SMC hodowano 24 godziny przed eksperymentem na pożywce insulinowej / transferyny (IT) bez FBS, jak opisano wcześniej (39). SMC były rutynowo charakteryzowane przez immunobarwienie anty-SMC-aktyny Ab (Enzo Diagnostics Inc., Farmingdale, New York, USA). Jednojądrzaste fagocyty izolowano przez wirowanie w gradiencie gęstości, a następnie elucję w przeciwprądzie ze świeżo przygotowanych ludzkich PBMC uzyskanych z leukopaków zdrowych dawców. Czystość jednojądrzastych fagocytów była równa lub większa niż 96%, jak określono za pomocą analizy FACS (anty-ludzkie mAb CD68 FITC, PharMingen, San Diego, Kalifornia, USA). Komórki hodowano w pożywce RPMI-1640 (BioWhittaker Inc.) zawierającej 5% ludzkiej surowicy (Sigma Chemical Co.). Dwadzieścia cztery godziny przed stymulacją komórki inkubowano w pożywce RPMI-1640 bez surowicy. Podłoża hodowlane i FBS zawierały mniej niż 40 pg / ml endotoksyny, jak określono za pomocą chromogennego testu limo amoebocytów (QLC-1000, BioWhittaker Inc.). Analiza biochemiczna ludzkich zmian miażdżycowych. Zamarznięta tkanka z pięciu nieseroskrzeliczych aort i tętnic szyjnych oraz 12 płytek szyjnych została zdehomogenizowana na płytki włókniste i miażdżycowe według kryteriów morfologicznych, jak opisano wcześniej (9). Próbki homogenizowano (Ultra-Turrax T 25, IKA-Labortechnik, Wilmington, North Carolina, USA), poddawano lizie (0,3 g tkanka / ml w 10 mM fosforanie sodu, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS 0,5% dezoksycholanu sodu, 0,2% azydku sodu), sklarowane (13 000 g, 15 minut), a stężenie białka oznaczono za pomocą testu z kwasem bicynchoninowym (BCA) (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA). Pięćdziesiąt mikrogramów całkowitego białka zastosowano do analizy Western blot. Immunoprecypitacja i zymografia. Supernatanty hodowli SMC lub odpowiednie rekombinowane MMP preinkubowane z TFPI-2 (1 godzina, 37 ° C) inkubowano z króliczym anty-ludzkim TFPI-2 Ab lub nieimmunizowanym króliczym IgG (18 godzin, 4 ° C), i wytrącony przez późniejsze dodanie koziego anty-króliczego IgG (18 godzin, 4 ° C, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) i kulki białka A-Sepharose (2 godziny, 4 ° C, Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, New Jersey, USA)
[patrz też: łowisko u roberta, leclerc godziny otwarcia, błonnik witalny gdzie kupić ]
[patrz też: sprzęt rehabilitacyjny dla dzieci, sezam właściwości lecznicze, biustonosze na duzy biust ]