Skip to content

Zgodne dane dotyczące morfologii i ekspresji genów pokazują, że szczepionka zatrzymuje zmiany przednowotworowe HER-2 / neu cd

2 miesiące ago

198 words

Wyniki następnie eksprymowano jako komórki efektorowe LU20 / 107 (18), z jednostkami litycznymi20 (LU20) zdefiniowanymi jako liczba komórek efektorowych potrzebnych do zabicia 20% komórek docelowych. IFN-. test wykrywania. Spc stymulowano za pomocą Abs do CD28 i do CD3 (końcowe stężenie ug / ml, Pharmingen, San Diego, Kalifornia, USA) przez 3 godziny. Komórki IFN – (3 + oznakowano Ab do IFN-y. (klon R4-6A2) skoniugowany z mAb z CD45 (klon 30S11) (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Niemcy) przez 5 minut na lodzie, następnie inkubowano przez 45 minut w 37 ° C. Uniknięto krzyżowego barwienia zachowując gęstość × 105 komórek / ml. IFN-. związany z matrycą wychwytującą barwiono sprzężonym z PE mAb. s do IFN-y. (klon AN.18.17.24; Miltenyi Biotec GmbH). Mikrokulki anty-PE zostały użyte do wzbogacenia komórek barwionych PE- (IFN – a) with w dwie rundy na separatorze magnetycznym (MS + MACS, Miltenyi Biotec GmbH). Komórki wybarwiono kontrastowo mAbs do CD4 lub CD8a-FITC (Pharmingen) i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Mikroskopia konfokalna. Komórki TUBO hodowano w DMEM w 0,1% FBS przez 24 godziny. Komórki przemyto i inkubowano przez 3 godziny w 37 ° C i 4 ° C z surowicami (rozcieńczonymi 1:20) pochodzącymi od immunizowanych myszy. Komórki następnie utrwalano przez 5 minut PBS <4% paraformaldehydem (Sigma-Aldrich), permeabilizowano przez 7 minut z PBS . 0,2% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) i zablokowano PBSa 10% BSA (Sigma-Aldrich). ) przez 20 minut. Ekspresję błonową i cytoplazmatyczną rp185neu oceniano przez barwienie skoniugowaną z antygenem IgG Alexa Fluor 488 (koza (1 godzina, 2 ug / ml; Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA). Przygotowanie próbki mikromacierzy. Całkowity RNA (ttlRNA) ekstrahowano i oczyszczano z gruczołów sutkowych myszy kontrolnych i transgenicznych, jak opisano w podręczniku Affymetrix (Affymetrix Inc., Santa Clara, California, USA). ttlRNA poddano następnie spektrofotometrycznemu określeniu ilościowemu i sprawdzono przez elektroforezę w żelu denaturującym z żelu agarozowego. TtlRNA niskiej jakości odrzucono, a ttlRNA pojedynczego zwierzęcia połączono w pulę w celu uzyskania trzech powtórzeń dla gruczołów sutkowych 2-tygodniowej ciężarnej myszy WT BALB / c (wk2prg), 22-tygodniowych nieleczonych myszy BALB-neuT (wk22nt). ) i 22-tygodniowych zagnieżdżonych i wzmocnionych myszy BALB-neuT (wk22pb) i dwóch powtórzeń dla gruczołów sutkowych 10-tygodniowych nieleczonych myszy BALB-neuT (wk10nt). Wytworzono cRNA i hybrydyzowano na 11 próbkach DNA Affymetrix MG-U74A v2 zgodnie z protokołem Affymetrix. ttlRNA (20 .g) zastosowano do przygotowania dwuniciowego cDNA z zastosowaniem systemu doboru SuperScript i startera T7 z oligo (dT) 24 zakotwiczonego (Invitrogen Corp., Carlsbad, California, USA). Następnie cDNA wykorzystano jako matrycę do syntetyzowania biotynylowanego cRNA (5 godzin, 37 ° C) za pomocą zestawu BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit (Enzo Life Science Inc., Farmingdale, New York, USA). Produkty transkrypcji in vitro oczyszczono na kolumnach do wirowania RNeasy (Qiagen, Hilden, Niemcy). Biotynylowane cRNA potraktowano następnie (35 minut w 94 ° C w buforze złożonym z 200 mM octanu Tris o pH 8,1, 500 mM octanu potasu i 150 mM octanu magnezu). Układy macierzy Affymetrix 11 MG-U74A v2 hybrydyzowano z biotynylowanym cRNA (15 .g / czips, 16 godzin, 45 ° C) stosując bufor do hybrydyzacji i kontrolę zapewnioną przez producenta (Affymetrix Inc.). Stację GeneChip Fluidics 400 (Affymetrix Inc.) używano do mycia i barwienia macierzy. Standardowy protokół zaproponowany przez producenta został wykorzystany do wykrycia hybrydyzowanego biotynylowanego cRNA. Następnie chipy skanowano za pomocą specjalnego skanera (Affymetrix Inc.) w celu wygenerowania plików danych cyfrowych (DAT). Analiza danych mikromacierzy i tworzenie klastrów. Pliki DAT zostały przeanalizowane przez MAS 5.0 w celu wygenerowania znormalizowanych danych obrazu (pliki CEL). Wartości intensywności zestawu sond zostały uzyskane za pomocą metody analizy wielościeżkowej (19). Pełny zestaw danych został znormalizowany zgodnie z niezmienną metodą zbioru (20). Procedura w kształcie lejka opisana przez Saviozzi i in. (21) został następnie zastosowany. Otrzymane 5,482 zestawy sond przeanalizowano, łącząc dwa podejścia statystyczne zastosowane w analizie istotności mikromacierzy (22): metoda dwóch niesparowanych próbek i test odpowiedzi wieloklasowej (szczegółowy opis procedury jest dostępny pod adresem http: //www.bioinformatica. unito.it/bioinformatics/Forni/additional_info/ (23) Analiza ta dała w sumie 2179 zestawów sond różnicujących się w co najmniej jednej z trzech grup eksperymentalnych, a ważność metody została zademonstrowana przez ocenę RT-PCR w czasie rzeczywistym. ekspresji kilku genów związanych z nowotworem (patrz dodatkowe informacje, odnośnik 23) 2117 zestawów sond przekształcono w wirtualne eksperymenty z dwoma barwnikami porównując wszystkie powtórzenia każdej grupy eksperymentalnej z powtórzeniami wk2prg (tj. wk10ntj / wk2prgi; wk22nti / wk2prgi; wk22pbi / wk2prgi, gdzie j = 1. 2 i i = 1. 3) [patrz też: sanatoria nad morzem nfz, polipy woreczka żółciowego, łowisko mąkolno ] [przypisy: biustonosze na duzy biust, polipy woreczka żółciowego, na czym polega rezonans magnetyczny ]