Skip to content

Skierowanie na fibroblasty związane z nowotworem poprawia chemioterapię raka poprzez zwiększenie wewnątrznormalnego poboru leku ad 7

4 tygodnie ago

664 words

Samice myszy BALB / c, w wieku 6. 8 tygodni, otrzymano od The Scripps Research Institute Rodent Breeding Facility. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z Przewodnikiem NIH dla opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zatwierdzonym przez Komisję ds. Pielęgnacji Zwierząt Scripps Research Institute. Podwójnie atenuowany szczep RE88 typ88 (AroAa .) został dostarczony przez Remedyne Corp. Komórki raka sutka D2F2 myszy były prezentem od Wei-Zen Wei (Department of Immunology, Karmanos Cancer Institute, Detroit, Michigan, USA), i Komórki raka okrężnicy CT26 początkowo otrzymano z ATCC, a następnie hodowano przez kilka miesięcy w celu uzyskania chemo-opornych subklonów. Charakterystyka wektorowa i komórkowa. CDNA kodujące mysie FAP (dostarczone przez JD Cheng, Wydział Onkologii Medycznej, Fox Chase Cancer Center, Filadelfia, Pensylwania, USA), IL-2 (ATCC) i CCL21 (InvivoGen) subklonowano do pcDNA3.1 / V5- Wektor His-TOPO (Invitrogen). W przypadku przejściowych transfekcji komórki CT26 lub D2F2 poddano elektroporacji, jak opisano uprzednio (45). Ekspresję białka pFap (pCCL21 i pIL2 nie pokazano) wykazano za pomocą Western blot z poliklonalnym króliczym przeciwciałem anty-mysim FAP dostarczonym przez JD Cheng. Komórki raka mysich CT26 i D2F2 hodowano w obecności 1% DMSO, etopozydu, 5-fluorouracylu, doksorubicyny, winblastyny lub paklitakselu (Sigma-Aldrich) we wskazanych stężeniach. Po 48 godzinach zliczenia apoptotyczne zliczano po inkubacji z barwnikiem specyficznym dla DNA Hoechst 33342 (2 (M, Invitrogen). Szczepienie doustne, prowokacja komórkami nowotworowymi i leczenie doksorubicyną i przeciwciałami przeciwko komórkom efektorowym. W doświadczeniach w ustawieniu profilaktycznym myszy BALB / c (n = 8) immunizowano 3 razy w odstępach 1-tygodniowych przez zgłębnik za pomocą 100 ul PBS zawierającego 109S. typhimurium (AroAa .) transformowane wskazanymi wektorami plazmidowymi, jak opisano wcześniej (26). Zwierzęta prowokowano 10 dni później przez wstrzyknięcie podskórne komórek raka okrężnicy 3 x 104 CT26 na lewym przednim boku lub przez ortotopowe wstrzyknięcie 3 × 105 komórek raka sutka D2F2 w nr. 4 sutkowe wkładki tłuszczowe. Objętość guza mierzono w 2 wymiarach i obliczano jako długość / 2 x szerokość2. W eksperymentalnym ustawieniu terapeutycznym początkową inokulację komórek nowotworowych iv komórkami raka okrężnicy x 105 CT26 śledzono 3 i 10 dni później za pomocą szczepionek doustnych. Po 18 dniach zważono płuca (normalna masa płuc = 0,2 g) i przerzuty do guza płucnego zbadano i oceniono wizualnie, oceniając procent powierzchni płuc pokrytej przez skondensowane przerzuty w następujący sposób: 0 = 0%, = <20% , 2 = 20 ~ 50%, 3 => 50%. Leczenie doksorubicyną przeprowadzono w eksperymentalnych grupach myszy (n = 8) z 10 mg / kg doksorubicyny (Sigma-Aldrich) podanych dożylnie 5, 10 i 15 dni po prowokacji komórkami nowotworowymi w warunkach profilaktycznych. W warunkach terapeutycznych myszy immunizowano co tydzień, począwszy od dnia 5 po prowokacji komórkami nowotworowymi; doksorubicynę podawano co tydzień zawsze dzień po immunizacji, jak wskazano. W celu zubożenia limfocytów T CD4 + i CD8 + lub subpopulacji komórek NK, przeciwciała (500 .g) skierowane przeciwko CD4 (klon GK 1.5) lub CD8 (klon 2.43), oba z National Cell Culture Center (Minneapolis, Minnesota, USA), lub przeciwciało anty-asialo-GM1 (Wako) wstrzykiwano ip co 7 dni, rozpoczynając dzień przed prowokacją komórkami nowotworowymi. Cytotoksyczność limfocytów T CD8 +. Dziesięć dni po ostatniej z 3 immunizacji w odstępach 1-tygodniowych, zebrano splenocyty z zaszczepionych grup myszy BALB / c (n = 4). Stosując CD8a MicroBeads (Miltenyi Biotec), komórki CD8 + oczyszczono zgodnie z protokołem producenta. Komórki następnie stymulowano w 5-dniowej hodowli przez komórki CT26 poddane napromieniowaniu (y (1000 Gy, 45 minut) przejściowo transfekowane pustym wektorem lub pFap. Następnie limfocyty T CD8 + hodowano z komórkami rakowymi CT26 (stosunek efektor do docelowego = 100: 1) przejściowo transfekowanymi albo GFP (pEGFP; Clontech) jako kontrolą albo GFP plus pFap. Po 48 godzinach oceniano apoptozę jądrową w sposób opisany uprzednio (45) za pomocą specyficznego dla DNA barwnika Hoechst 33342 (2. M). W teście uwalniania 51Cr, myszy BALB / c (n = 3) immunizowano 4 razy w cotygodniowych odstępach. Splenocyty zebrano 13 dni po ostatniej immunizacji i inkubowano przez 5 dni z fibrydami A31 (1000 Gy, 45 minut) z A-31, które zostały retrowirusowo zainfekowane pFap. Pobudzone splenocyty następnie inkubowano przez 4 godziny ze znakowanym A31-pFap i obliczono procent lizy
[przypisy: sezam właściwości lecznicze, polipy woreczka żółciowego, na czym polega rezonans magnetyczny ]
[więcej w: u bogdana, lowisko zgoda, sprzęt rehabilitacyjny dla dzieci ]