Skip to content

Czynnik transkrypcyjny Lm-homeodomena Lmx1b odgrywa kluczową rolę w podocytach cd

1 miesiąc ago

433 words

Komórki COS-7 przejściowo transfekowano zgodnie ze standardowymi protokołami z DEAE-dekstranem i chlorochiną (17). Warunkalnie unieśmiertelniona linia komórkowa mysiego podocytu (18) była przejściowo transfekowana Lipofectamine 2000 zgodnie z instrukcjami producenta (Life Technologies GmbH, Karlsruhe, Niemcy). Trzy dni po transfekcji przygotowano lizaty komórkowe i oznaczono aktywność lucyferazy. Stwierdzono stabilnie transfekowane komórki HtTA-1 (komórki HeLa wyrażające transaktywator tetracykliny) (19) z protokołem opartym na poli-L-ornitynie (20). Testy przesunięcia żelu. Próby przesunięcia żelu i wytwarzanie ekstraktów jądrowych przeprowadzono zasadniczo zgodnie ze standardowymi protokołami (17). Pełnej długości ludzki cDNA LMX1B subklonowano do bakteryjnego wektora ekspresyjnego pET21b (Novagen, Madison, Wisconsin, USA), a rekombinowane białko oczyszczono zgodnie z instrukcjami producenta. Sprzężoną in vitro transkrypcję i translację przeprowadzono za pomocą układu Lizat retikulocytów sprzężonych z TNT T7 z Promega GmbH, Mannheim, Niemcy. Następujące dwuniciowe oligonukleotydy zastosowano do testów przesunięcia żelu: jeden z pierwszego intronu ludzkiego genu COL4A4 ((COL4A4 A: 5a-GAT CCA TGA AAG TAA TTA TTT TCA-3a i 5 (3 -GAT CTG AAA ATA ATT ACT TTC ATG-3a) i trzy z przypuszczalnego regionu promotora ludzkiego genu NPHS2 (1087, zaczynając od pozycji 1087 powyżej kodonu start: 5 a -aga AAC AAA TTA TTA ACA GAA AGT-3 a i 5–ACT TTC TGT TAA TAA TTT GTT TCT-3a, 837, rozpoczynając w pozycji 837: 5a-ATA GCA TTA ATA AAG ACC CTA AAT AAT AAC AGA G-3a i 5p – CTC TGT TAT TAT TTA GGG TCT TTA TTA ATG CTT A-3P i 287, rozpoczynając w pozycji A 287: 5C-CCT GCC CGG GGC CGG CTC TCC CAC-3 (3 i 5 (3 -GTG GGA GAG CCG GCC CCG GGC AGG-3.). Radioaktywnie znakowane oligonukleotydy odpowiadające 50 000 cpm inkubowano przez 30 minut ze wskazanym źródłem białka LMX1B, a następnie poddano działaniu 5% żelu poliakryloamidowego przy 150 V przy stałym chłodzeniu. Po przeprowadzeniu supershiftów z ekstraktami jądrowymi, przeciwciało anty-epitopowe 9E10 zostało dodane w tym samym czasie, co ekstrakt jądrowy, a mieszaninę inkubowano również przez 30 minut. Wyniki Charakterystyka morfologiczna fenotypu kłębuszkowego. Można już było zauważyć, przez badania brutto, że nerki od Lmx1b. /. myszy były mniejsze niż te ze zwierząt Lmx1b + / +, co sugeruje, że rozwój nerek u homozygotycznych zwierząt z nokautem był opóźniony. Przegląd poszczególnych odcinków nerki wskazywał w tym samym kierunku, ponieważ okazało się, że mniej dojrzałe kłębuszki nerkowe z Lmx1b. /. myszy. Po określeniu średniej powierzchni kłębuszkowej kłębka, była ona znacznie mniejsza w Lmxlbp./. myszy (1426. m2) niż myszy Lmx1b + / + (1756. m2) i Lmx1b + /. myszy (1782 m2) (P <0,05, ANOVA). Transmisyjna mikroskopia elektronowa kłębuszków z Lmx1b. /. myszy wyraźnie wykazały, że kłębuszki nie były w pełni zróżnicowane. W odróżnieniu od nerek typu dzikiego, w których rozgałęziona sieć naczyń włosowatych rozwinęła się w kłębuszkach nabłonka (ryc. 1a), naczynia włoskowate w kłębuszkach od myszy homozygotycznych z nokautem nie były rozgałęzione (ryc. 1b). Ponadto zauważyliśmy, że kłębuszkowe komórki śródbłonka myszy z nokautem były mniej fenestrowane (fig. 1, c i d). W celu zebrania wstępnych dowodów na to, dlaczego nie doszło do rozgałęzienia i dlaczego śródbłonek zawiera mniej fenestry, przeprowadziliśmy hybrydyzację in situ i test ochrony przed RNazą dla VEGF. Chociaż mRNA VEGF wykryto w podocytach zarówno z Lmx1b + / +, jak i Lmxlbp / r. myszy przez hybrydyzację in situ (fig. 1, e i f), w wielu (ale nie we wszystkich) przypadkach stwierdzono mniej mRNA VEGF w nerkach z myszy z nokautem za pomocą testu ochrony przed RNazą (Figura 1g). Rycina 1. Rozwój naczyń włosowatych kłębuszkowych w Lmx1b. /. myszy. Porównanie noworodków myszy typu dzikiego (a) i homozygotycznych myszy z nokautem (b) wykazuje poważny opóźniony wzrost naczyń włosowatych kłębuszkowych, gdy gen Lmx1b jest inaktywowany. Co więcej, materiał włóknisty można wykryć w przestrzeni Bowmana i sąsiednich proksymalnych kanalikach Lmx1b. /. myszy (gwiazdka w b). Przy większym powiększeniu, redukcję, a czasem nawet całkowity brak otoczki w śródbłonku można zaobserwować u myszy z nokautem (d) (strzałki w punkcie c do fenestrae w śródbłonku kłębuszkowym myszy typu dzikiego). Chociaż przez hybrydyzację in situ mRNA VEGF można wykryć na podocytach zarówno typu dzikiego (e), jak i Lmx1b (3). (f) myszy, test ochrony przed RNazą z 20 .g całkowitego RNA nerek (przygotowanego z pięciu myszy Lmx1b + / + i czterech myszy Lmx1b (3 (y)) wykazuje obniżone poziomy mRNA VEGF w nerkach myszy z nokautem (tRNA służyło jako negatywny kontrola) [więcej w: biustonosze na duzy biust, sprzęt rehabilitacyjny dla dzieci, u bogdana ] [przypisy: dieta montignaca przepisy, ciśnienie atmosferyczne a samopoczucie, biedronka świątniki górne ]