Skip to content

Czynnik transkrypcyjny Lm-homeodomena Lmx1b odgrywa kluczową rolę w podocytach ad

1 miesiąc ago

110 words

Przygotowano skrawki o grubości czterech mikrometrów i zabarwiono hematoksyliną i eozyną. Około dziesięć kłaczków kłębuszkowych (zdefiniowanych jako profile, które przeszły poza stadium ciała w kształcie litery S) zliczono losowo na 24 sekcje nerki, utrzymując tym samym dwa kłębki tego samego kłębka. Dla każdej nerki analizowano 100 kłaczków kłębuszkowych i obliczano średnią powierzchnię pęczka. Immunohistochemia. W przypadku kriosekcji nerki utrwalano przez noc w × PBS / 4% paraformaldehydzie, z wyjątkiem przypadków, w których stosowano przeciwciała anty-kolagen IV (patrz poniżej). Po zrównoważeniu x PBS / 18% sacharoza, nerki zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze <80 ° C aż do dalszego użycia. Krioskrawki o ciężarze 7 do 10- (3 zablokowano w x PBS / 2% BSA przed wybarwianiem pierwszorzędowym przeciwciałem przez godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przez noc w 4 ° C. Następnego dnia rano, skrawki przemywano PBS i barwiono przez godzinę odpowiednim drugorzędowym przeciwciałem. W celu barwienia przeciwciałami anty-kolagen IV, nerki natychmiast zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze <80 ° C aż do dalszego użycia. Krioskrawki o ciężarze 7 do 10 .m sklejono acetonem przez 10 minut w temperaturze -20 ° C, a następnie wysuszono na powietrzu. Po denaturacji tkanki przez 60 minut za pomocą 6 M mocznika / 0,1 M glicyny, pH 3,5, skrawki przemyto trzykrotnie x PBS, a następnie zablokowano jak opisano powyżej (10). W przypadku skrawków parafinowych nerki utrwalano 4 godziny w temperaturze pokojowej w x PBS / 4% paraformaldehyd, a następnie zatapiano w parafinie. Skrawki parafinowe o grubości czterech mikrometrów odparowano i ponownie uwodniono przed pięciokrotnym ogrzewaniem mikrofalowym, przez 5 minut za każdym razem, w 10 mM cytrynianie sodu. Po obróbce mikrofalami wolne grupy aldehydowe blokowano przez 15 minut 0,1 M NH4Cl, endogenną biotynę blokowano zestawem blokującym Avidin / biotyna zgodnie z instrukcjami producenta (Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, USA), i endogenna peroksydaza była inaktywowana przez inkubację przez 5 minut z 3% H2O2. Wykrywanie immunohistochemiczne osiągnięto za pomocą zestawu RTU VECTASTAIN Universal Elite ABC (Vector Laboratories Inc.), gdy zastosowano pierwszorzędowe przeciwciało nie zawierające aminy oraz zestaw do VECTOR MOM Immunodetection Kit (Vector Laboratories Inc.) przy zastosowaniu mysiego pierwszorzędowego przeciwciała; w obu przypadkach jako substrat stosowano diaminobenzydynę (DAB). Zastosowano następujące przeciwciała pierwotne: poliklonalne królicze przeciwciało integryny antyA3 (rozcieńczone 1: 3000, Chemicon International Inc., Hofheim, Niemcy), poliklonalne królicze przeciwciało przeciw nefrynie (rozcieńczone 1: 1500) (11), poliklonalne przeciwciało przeciwko podocalyksynom kurczaka (rozcieńczone 1: 1500), poliklonalne królicze przeciwciało anty-podocynowe P35 (rozcieńczone 1: 3000) (12), poliklonalne królicze przeciwciało przeciw synaptodynie (rozcieńczone 1: 650) (13), poliklonalne królicze przeciwciało anty-CD2AP (rozcieńczone 1: 4000) (14), poliklonalne królicze przeciwciało przeciw-entaktynie (rozcieńczone 1: 2000), poliklonalne królicze przeciwciało przeciw fibronektynie (rozcieńczone 1: 600, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Niemcy), monoklonalne mysie przeciwciało przeciw dystroglikanowi (rozcieńczone 1:80; Novocastra Laboratories Ltd., Dossenheim, Niemcy), poliklonalne królicze przeciwciało przeciw kolagenowi IV (4 rozcieńczone 1: 800) (15) i królicze poliklonalne przeciwciało anty-WT1 (rozcieńczone 1: 500; Santa Cruz Biotechnology Inc., Heidelberg, Niemcy). Wtórnymi przeciwciałami były skoniugowane z Cy3 kozie anty-królicze IgG (rozcieńczone 1: 500, Dianova, Hamburg, Niemcy), skoniugowane z Cy3 osiołone przeciwciało IgY (rozcieńczone 1: 500, Dianova) i biotynylowane kozie anty-królicze IgG (rozcieńczone 1: 250, Vector Laboratories Inc.). Nieradioaktywna hybrydyzacja in situ. Utrwalanie i dzielenie nerek przeprowadzono jak opisano powyżej dla kriosekcji. Hybrydyzację in situ przeprowadzono zasadniczo jak opisano wcześniej (16). Zastosowano następujące cDNA: mysie cDNA VEGF120 0,45 kbp, mysie cDNA Foxc2 około 2 kbp i mysie cDNA podociny 3,2 kb. Test ochrony przed RNazą. Całkowity RNA z nerki nowonarodzonych myszy wyizolowano przy użyciu techniki kwas-guanidynowo-fenol-chloroform, a testy ochrony przed RNazą przeprowadzono zgodnie ze standardowymi protokołami (17). Antysensowny RNA wytworzono przez transkrypcję in vitro z następujących fragmentów: mysiego fragmentu CD2AP (IMAGp998N2210255Q2), fragmentu ludzkiego i mysiego podociny, mysiego fragmentu synaptopodyny (IMAGp998B059189Q2), mysiego fragmentu VEGF i fragmentu cDNA 18S (Ambion Inc. ., Austin, Texas, USA). W przypadku cDNA 18S zastosowano 50 ng całkowitego RNA z nowonarodzonych nerki myszy; we wszystkich innych przypadkach analizowano 20 .g całkowitego RNA, a odpowiednie ilości tRNA z Escherichia coli służyły jako kontrola negatywna. Przejściowe i stabilne transfekcje [hasła pokrewne: łowisko u bogdana, łowisko mąkolno, mozga kanaryjska gdzie kupić ] [przypisy: leclerc godziny otwarcia, jak naturalnie rozjaśnić włosy, nefrolog dziecięcy wrocław ]