Skip to content

Czynnik transkrypcyjny Lm-homeodomena Lmx1b odgrywa kluczową rolę w podocytach ad 5

1 miesiąc ago

763 words

Test ochrony z sondą skierowaną przeciwko 18S rRNA pokazuje, że stężenie RNA zostało określone prawidłowo (e). Immunohistochemiczne wykrywanie białek przeprowadzono za pomocą DAB, a mRNA wykryto metodą nieradioaktywnej hybrydyzacji in situ (w celu zademonstrowania ujemnego kłębuszka, obraz pokazany w d został zrobiony przy użyciu optyki Nomarskiego). Pasek: 20 m (aib), 40 m (c i d). Ponieważ brak mRNA podociny wskazywał na defekt transkrypcyjny, przypuszczalny region promotora ludzkiego NPHS2, genu kodującego podocynę, przeszukiwano pod kątem możliwych miejsc wiązania LMX1B. Chomikowe białko Lmx1a, którego homeodomena jest identyczna z ludzkim LMX1B (32), rozpoznaje dwa pokrewne motywy bogate w AT zwane FLAT-E (5a-TAATTA-3a) i FLAT-F (5a-TTAATAAT-3). a) elementów (33), a zatem zasadne było założenie, że LMX1B wiąże się z podobnymi motywami. Znaleźliśmy jeden idealny element FLAT-F rozciągający się od nukleotydów 1079 do 1072 i dwa blisko oddalone niedoskonałe elementy FLAT-E rozciągające się od nukleotydów 832 do 809 powyżej kodonu start w promotorze NPHS2. Oligonukleotydy zawierające te pierwiastki, ale nie oligonukleotyd bogaty w GC bliżej kodonu start, rozpoznano z pełnej ekspresji bakterii białka LMX1B w analizie przesunięcia żelu (Figura 5a). Wiązanie było specyficzne, ponieważ przesunięcia zanikły, konkurując z nadmiarem tego samego nieznakowanego oligonukleotydu, ale nie z nadmiarem nieznakowanego niespecyficznego oligonukleotydu (Figura 5b). Ponadto,. COL4A4. 1087,. i. 837. oligonukleotydy były zdolne do konkurowania ze sobą (dane nie pokazane). Aby wykluczyć możliwość, że białko ulegające ekspresji w bakteriach nie uległo poprawnemu składaniu, zastosowaliśmy również in vitro. Translację homeodomeny LMX1B i ekstraktów jądrowych ze stabilnie transfekowanych komórek HeLa w testach zmiany żelowej. (Korzystaliśmy z homeodomeny, ponieważ niespecyficzne przesunięcie miało tendencję do maskowania przesunięcia uzyskanego z białkiem LMX1B tłumionym in vitro.). Ponownie wykazaliśmy wiązanie (Figura 5, c i d). Aby określić, czy rozpoznanie tych miejsc wiązania przez LMX1B w przypuszczalnym promotorze NPHS2 jest wystarczające, aby doprowadzić do jego aktywacji, przejściowo transfekowaliśmy komórki COS-7 i warunkowo unieśmiertelnioną linię komórkową mysiego podocytu (18) plazmidem ekspresyjnym LMX1B i lucyferazą. plazmid reporterowy zawierający około 4,4 kbp przypuszczalnego regionu promotora NPHS2 (rozciągający się od 4303 pz w górę do 129 pz poniżej kodonu start). Jednak nawet po wielokrotnych próbach nie można było dostrzec efektu regulacyjnego LMX1B na plazmidzie reporterowym. Ponadto, stosowaliśmy stabilnie transfekowane komórki HeLa, które po usunięciu doksycykliny indukowalnie eksprymują LMX1B, w celu ustalenia, czy endogenny gen podociny odpowiedział na indukcję LMX1B, ale ponownie nie zauważono żadnego efektu (dane nie pokazane). Figura 5 Testy przesunięcia żelu pokazujące wiązanie LMX1B z elementami FLAT-E i FLAT-F w regionie promotora NPHS2. Testy przesunięcia żelu przeprowadzono z oligonukleotydem z pierwszego intronu ludzkiego genu COL4A4 COL4A4, którego rozpoznanie przez LMX1B wykazano przed (38) i dlatego służyło jako kontrola pozytywna; oligonukleotyd zawierający doskonały element FLAT-F (. 1087); oligonukleotyd zawierający dwa niedoskonałe pierwiastki FLAT-E (a 837); i oligonukleotyd bogaty w GC nie zawierający ani elementu FLAT-E, ani elementu FLAT-F (a287). (a) Dwieście pięćdziesiąt i 500 ng pełnej długości białka LMX1B eksprymowanego bakteryjnie rozpoznaje nie tylko miejsce wiązania w intronie COL4A4, ale także doskonałe FLAT-F i niedoskonałe elementy FLAT-E, podczas gdy oligonukleotyd bogaty w GC nie jest granica. np. oligonukleotyd bez dodatku białka. (b) Testy kompetycyjne z zastosowaniem 500 ng pełnej długości białka LMX1B eksprymowanego bakteryjnie oraz 25-krotny, 100-krotny i 400-krotny nadmiar molowy wskazanych nieznakowanych oligonukleotydów wykazują specyficzność przesunięcia żelu. Oznakowane oligonukleotydy są wskazane na górze, nieoznakowane oligonukleotydy poniżej. nc, nie dodano konkurencyjnego nieznakowanego oligonukleotydu. (c) Cztery mikrolitry homeodomeny LMX1B in vitro pR inkubowano z opisanymi powyżej oligonukleotydami. Łatwo zauważyć, że homeodomena (HD) rozpoznaje miejsce wiązania w intronie COL4A4, idealny element FLAT-F i niedoskonałe elementy FLAT-E, ale nie oligonukleotyd bogaty w GC. Określone pasma są oznaczone strzałkami; można również zobaczyć inne prążki, w których do reakcji transkrypcji / translacji in vitro (H2O) nie dodano DNA. (d) Ekstrakty jądrowe wytworzono z trwale transfekowanych komórek HeLa indukowalnie eksprymujących znakowane epitopem myc białko LMX1B pełnej długości, i użyto 6. g białek jądrowych z nieindukowanych (. off.) i indukowanych (a na.) komórek do test przesunięcia żelu
[hasła pokrewne: biedronka świątniki górne, łowisko u roberta, na czym polega rezonans magnetyczny ]
[patrz też: prohormony skutki uboczne, łowisko mąkolno, łowisko u bogdana ]