Skip to content

Trombina aktywuje białko wiążące Y-Box (białko wiążące DNA B) w komórkach śródbłonka

1 miesiąc ago

794 words

Trombina stymuluje ekspresję wielu genów w komórkach śródbłonka (EC), ale czynniki działające w układzie trans odpowiedzialne za tę indukcję pozostają nieokreślone. Wcześniej opisaliśmy czynnik jądrowy indukowalny trombiną (TINF), który wiąże się z elementem w promotorze PDGF B i jest odpowiedzialny za indukowalność tego genu dla trombiny. Nieaktywny cytoplazmatyczny TINF jest szybko aktywowany i przenoszony do jądra EC po stymulacji trombiną. Obecnie oczyszczamy TINF z EC traktowanych trombiną. Sekwencjonowanie aminokwasów ujawniło, że jest on członkiem rodziny białek Y-box, a jedyny kodowany przez białko Y cDNA kodujący cDNA, który wykryliśmy w ludzkich lub bydlęcych EC odpowiadał białku B wiążącemu DNA (dbpB). DbpB ulega translokacji do jądra po stymulacji EC przez trombinę, co pokazano na podstawie analizy FACS jąder z EC wyrażających białka fuzyjne GFP-dbpB. Podczas aktywacji trombiny stwierdzono, że dbpB ulega rozszczepieniu, dając fragment końcowy o długości 30 kDa, który rozpoznał sekwencję elementów odpowiedzi trombiny, ale nie sekwencję konsensusową Y-box. Preinkubacja EC z białkowymi inhibitorami fosfatazy tyrozynowej całkowicie zablokowała aktywację dbpB przez trombinę i zablokowała indukcję endogennego mRNA łańcucha B PDGF i aktywację promotora przez trombinę. Wiadomo, że białka Y-box konstytutywnie regulują ekspresję kilku genów. Aktywacja tej klasy czynników transkrypcyjnych w odpowiedzi na trombinę lub jakikolwiek inny agonista reprezentuje nową ścieżkę sygnałową. Wprowadzenie Trombina jest proteazą układu krzepnięcia i substancją agregującą płytki, która powinna występować w miejscach uszkodzenia naczyń. Trombina jest również silnym agonistą komórek śródbłonka (EC), a jej aktywacja wczesnych i późnych zdarzeń w tych komórkach była badana przez wiele lat (1. 7). Trombina powoduje indukcję wielu genów w EC i innych komórkach; jednakże mechanizm molekularny leżący u podstaw indukowanej przez trombinę ekspresji genów w EC lub w jakimkolwiek innym typie komórek pozostaje słabo poznany. Inni wcześniej zademonstrowali indukcję genu łańcucha PDGF B przez trombinę (8 (11, 11) i zidentyfikowaliśmy element o długości 9 pz w promotorze łańcucha PDGF B, który był odpowiedzialny za indukowaną przez trombinę transkrypcję tego genu (12). . Ten pierwiastek był konserwowany w promotorach łańcucha B PDGF wielu gatunków i występował także w wielu innych indukowalnych przez trombinę genach, takich jak czynnik tkankowy i łańcuch PDGFA. Zidentyfikowaliśmy także białko jądrowe zależne od trombiny, czynnik indukowalny indukowany trombiną (TINF), który specyficznie wiąże oligonukleotyd odpowiadający sekwencji elementu odpowiedzi trombiny (ThRE). Stwierdzono, że TINF jest konstytutywnie obecny w cytoplazmie EC w postaci niezwiązanej z DNA, ale ulegał aktywacji (związał oligonukleotyd odpowiadający ThRE) i został przeniesiony do jądra w odpowiedzi na trombinę (12). Tutaj informujemy, że TINF należy do rodziny białek Y-box. Białka Y-box, które są wysoce konserwowane z Escherichia coli przez ludzi, są białkami wiążącymi DNA, które uczestniczą zarówno w regulacji transkrypcji, jak i translacji. Jako regulatory transkrypcji działają zarówno jako supresory, jak i wzmacniacze (13). Kilka genów ma sekwencje Y-box w ich regionach promotorowych i uważa się, że są regulowane przez białka Y-box (MHC klasy II, MDR1, geny wirusa mięsaka Rous [RSV], żeby wymienić tylko kilka) (14. 28). Regulacja genów MHC klasy II przez białko Y-box została zdefiniowana za pomocą analizy mutacyjnej (29. 32). Dotychczas wykazano, że białka Y-box są konstytutywnie obecne w komórkach i odgrywają rolę w ekspresji konstytutywnych i indukowanych genów bez zmiany ich poziomu jądrowego. Żadne wcześniejsze doniesienia nie opisują konieczności aktywacji białka wiążącego Y-box w odpowiedzi na agonistę komórkowego. Ponadto, białka wiążące Y-boxa nie były wcześniej zaangażowane w regulację transkrypcji przez trombinę. Metody Materiały. Bydlęcą a-trombinę zakupiono w firmie USB Corp. (Cleveland, Ohio, USA). Endotoksyna została usunięta z tej trombiny przy użyciu wstępnie załadowanych kolumn Acticlean ETOX ze Sterogene (Arcadia, Kalifornia, USA). Pożywka DMEM / Ham F-12 (DMEM / F-12) pochodziła od Irvine Scientific (Santa Ana, Kalifornia, USA); FBS otrzymano z BioWhittaker Inc. (Walkersville, Maryland, USA). Tkanki do hodowli tkanek pochodziły z Costar (Corning Inc., Corning, New York, USA) i Becton Dickinson and Co. (Franklin Lakes, New Jersey, USA). NH2-D-Phe-Pro-Arg-chlorometyloketon (PPACK) pochodził z Bachem (Bubendorf, Szwajcaria); Kinaza T4 do znakowania końcowego oligonukleotydów z Boehringer Mannheim (Indianapolis, Indiana, USA); [A-32P] dATP, [14C] adenina i [a-32P] dCTP pochodziły z NEN Life Science Products (Boston, Massachusetts, USA); Q-Sepharose pochodziło z Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, New Jersey, USA); Spectrozyme TH (sól heksahydrotyrysylo-L-alanylo-L-arginino-p-nitroanilidowa) pochodzi z American Diagnostica (Greenwich, Connecticut, USA); Zestaw do izolacji mRNA od Boeh
[więcej w: łowisko u roberta, lowisko zgoda, polipy woreczka żółciowego ]
[przypisy: jak naturalnie rozjaśnić włosy, nefrolog dziecięcy wrocław, dieta montignaca przepisy ]