Skip to content

Trombina aktywuje białko wiążące Y-Box (białko wiążące DNA B) w komórkach śródbłonka cd

1 miesiąc ago

705 words

Dla 3. RACE, zastosowano dwa specyficzne startery: nie. 4, 5a-CCTAAACCACAAGATGGCAAAGAGAGAC-3. i nie. 5, 5a-GGCTTACCATCTCACCATCATCATCCGGT-3 .. Northern blotting. Ludzkie EC hodowano do konfluencji, płukano dwukrotnie pożywką zawierającą 1% FBS i inkubowano ze wskazanymi odczynnikami przez 6 godzin w 37 ° C. Pożywkę następnie odessano, komórki przemyto PBS, a całkowite RNA ekstrahowano odczynnikiem Trizol. RNA rozdzielono przez elektroforezę na żelu denaturującym formaldehydem, przeniesiono na membranę Nytran przez przeniesienie kapilarne i hybrydyzowano z sondami cDNA znakowanymi [32P] dCTP dla ludzkiego cDNA ludzkiego DNA PDGF (2,9 kb) lub cDNA GAPDH. Autoradiogramy zostały określone ilościowo za pomocą skomputeryzowanej densytometrii. Analiza dbpB. Prawie pełnej długości ludzkie cDNA DBPB uzyskano za pomocą RT-PCR, stosując opublikowaną sekwencję i mRNA wyizolowany z ludzkich EC jako matrycy. Oligonukleotyd o długości 120 pz odpowiadający 5. koniec został zsyntetyzowany (Midland Certified Reagent Co., Midland, Texas, USA) i poddany ligacji z produktem PCR z użyciem miejsca Bgl1 w DBPB. Pełnej długości cDNA DBPB ligowano do wektora pcDNA3. Skróconą DBPB wytworzono przy użyciu PCR przez wprowadzenie kodonu stop po 207 aminokwasach. Wektor pcDNA3 bez insertu zastosowano jako kontrolę. Transkrypcję in vivo i translację DBPB przeprowadzono stosując TNT T7 Quick Coupled Transcription / Translation System firmy Promega Corp. zgodnie z instrukcjami producenta. Przeciwciało przeciwko peptydowi końcowemu COOH z dbpB zostało przygotowane przez Biosynthesis Inc. (Lewisville, Texas, USA). Antygen był identyczny z peptydem stosowanym przez Shen i in. (34) w celu wytworzenia przeciwciała swoistego dla DBPB. Do sieciowania ultrafioletowego DBPB, sondę oligonukleotydową znakowaną 32P dodano do lizatu lub mieszaniny translacyjnej in vitro, a próbkę napromieniano przy 254 nm przez 45 minut. Po napromieniowaniu próbkę poddano SDS-PAGE (8-12% żeli). Immunoprecypitacja i analiza Western blot DBPB. DBPB poddano immunoprecypitacji z ekstraktów (100 ul), przygotowanych jak już tu opisano, przez inkubację ze stałym mieszaniem w temperaturze 4 ° C przez 2 godziny z surowicą odpornościową lub surowicą przed immunizacją (10 ul) i buforem (37 ul 50 mM). HEPES [pH 7,4], 150 mM NaCl, mM EDTA, 2,5 mM MgCl2 i 1% NP-40). Immobilizowane białko A / G (50 ul, Pierce Chemical Co.) dodano do mieszaniny i inkubowano przez 2 godziny w 4 ° C. Po odwirowaniu przez 5 minut przy 12 000 g, supernatant odrzucono i żel przemyto trzy razy buforem i jednokrotnie PBS. DBPB eluowano przez obróbkę cieplną w 60 ° C przez 30 minut w 50 .l PBS. Eluat poddano SDS-PAGE. W przypadku Western blotting, ekstrakty EC (75 .l) lub mieszaninę do translacji in vitro poddano 10% SDS-PAGE, a następnie przeniesiono na błonę PVDF (Immobilon-P, Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA). Membranę potraktowano antyserum anty-DBB C-COOH, a następnie metodą wykrywania chemiluminescencyjnego przy użyciu zestawu Immune-Star (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, California, USA). Transfekcja testów aktywności EC a i lucyferazy bydlęcej. EC bydlęce hodowano do poziomu konfluencji 95% w sześciostudzienkowych płytkach, płukano pożywką Optimem (Life Technologies Inc.) i transfekowano stosując Lipofectin (Life Technologies Inc.) z DNA (1 .g). Lucyferaza znajdowała się pod kontrolą fragmentu promotora o długości 400 pz genu łańcucha p PDGF B w wektorze pGL3-Basic (Promega Corp.). Wektor kontrolny pSV-P-galaktozydazy (Promega Corp.) kotransfekowano konstruktem lucyferazy w celu skorygowania skuteczności transfekcji i specyficzności różnych inhibitorów. Po 6-godzinnej transfekcji EC przemyto pożywką Optimem i inkubowano z odpowiednimi odczynnikami. Lizaty do testów lucyferazy i P-galaktozydazy przygotowano po 15 godzinach. Stwierdzono, że poziomy .-galaktozydazy są stałe i nie wpływają na nie inhibitory. Test lucyferazy przeprowadzono zgodnie z instrukcjami zestawu. Wszystkie grupy traktowania były potrójne i wszystkie eksperymenty powtarzano co najmniej trzy razy. Analiza FACS jąder z białka fuzyjnego białka fuzyjnego-dbpB wyrażającego EC. Pełnej długości DBPB i skrócone cDNA DBPB wklonowano do wektora EGFP-C3 z CLONTECH Laboratories Inc. (Palo Alto, Kalifornia, USA), a bydlęce EC przejściowo transfekowano konstruktami, jak już tu opisano. Komórki stymulowano przez 2 godziny 10 U / ml trombiny 36 godzin po transfekcji, przemywano PBS i lizowano przez inkubację w hipotonicznym buforze zawierającym inhibitory proteazy, a następnie rozcieranie z użyciem no. 26 igieł. Jądra granulowano przy 1000 g, płukano trzy razy PBS i analizowano za pomocą FACS (Becton Dickinson and Co.). Wykrywanie lokalizacji białka fuzyjnego GFP-dbpB za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
[podobne: ciśnienie atmosferyczne a samopoczucie, herbata czarna właściwości, nfz poznań piekary godziny otwarcia ]
[więcej w: nfz poznań piekary godziny otwarcia, sanatoria nad morzem nfz, prohormony skutki uboczne ]