Skip to content

Trombina aktywuje białko wiążące Y-Box (białko wiążące DNA B) w komórkach śródbłonka ad

1 miesiąc ago

639 words

(Rockford, Illinois, USA); i odczynnik Trizol, Lipofectin i oligo (dT) 12. 18 pochodziły z Life Technologies Inc. (Grand Island, New York, USA). Ortowanadan sodu zakupiono od Fisher Scientific (Fair Lawn, New Jersey, USA), tlenek fenyloarsztyny (PAO) i katepsynę G z Calbiochem-Novabiochem Corp. (San Diego, Kalifornia, USA), trypsynę z Worthington (Freehold, New Jersey, USA). USA), czynnik Xa i plazmina z Enzyme Research Laboratories (South Bend, Indiana, USA), błona Nytran z Micron Separation (Westboro, Massachusetts, USA), wektor kontrolny pSV-P-galaktozydazy i test lucyferazy i P-galaktozydazy. zestawy od Promega Corp. (Madison, Wisconsin, USA), paraformaldehyd z Electron Microscopy Sciences (Fort Washington, Pennsylvania, USA), i ośrodek montażowy Vectashield z jodkiem propidyny z Vector Laboratories (Burlingame, Kalifornia, USA). Wszystkie inne chemikalia, o ile nie zaznaczono inaczej, zakupiono od Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA). Stymulacja EC za pomocą trombiny i przygotowanie ekstraktów do testów zmian ruchliwości elektroforetycznej. Ludzkie żyły pępowinowe EC i bydlęcej EC były izolowane i hodowane jak opisano wcześniej (12). Zbierane komórki przemyto dwukrotnie pożywką bez FBS w przypadku bydlęcej EC lub pożywki zawierającej 1% FBS w przypadku ludzkich EC. EC potraktowano trombiną (3 . 10 U / ml) przez 2 godziny w 37 ° C. Pod koniec inkubacji i przed lizą komórek dodano 100-krotny molowy nadmiar inhibitora trombiny PPACK przez 10 minut w 37 ° C w celu inaktywacji trombiny związanej z powierzchnią komórki. Komórki przemyto dwukrotnie lodowato zimnym PBS, a następnie przygotowano ekstrakty cytosolowe i jądrowe, jak opisali Dignam i in. (33). Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) z 8% żelami akryloamidowymi przeprowadzono tak, jak to opisano wcześniej (12). Sondy reprezentowały dziki lub zmutowany ThREs promotora łańcucha B PDGF (12). Sekwencję ThRE ctCCACCCACC zmieniono w następujący sposób: CTGATTGGCCAA (konsensus Y-box); ctAAATGCACC (mutant 4-zasadowy); ctAAGTTTGAAG (mutant 9-zasadowy). Oczyszczanie TINF (białka wiążącego DNA B). Cytosolowe ekstrakty z EC traktowanych trombiną aorty (komórki a 108) przygotowano, jak już tu opisano. Ekstrakt poddano obróbce cieplnej (60 ° C przez 2 godziny), odwirowano przy 21000 g w wirówce Micromax (International Equipment Co., Needham Heights, Massachusetts, USA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej i zastosowano do Q-Sepharose (2 ml) w 0,1 M soli. Żel delikatnie mieszano z ml ekstraktu i ml glicerolu przez godzinę w 4 ° C. Frakcje wymywano stopniowo, stosując 4 ml 0,2, 0,3, 0,4 i 0,5 M KCl i 10 mM Tris (pH 7,5) z 25% gliceryną, mieszając w 4 ° C przez 30 minut. TINF eluowano przy 0,2. 0,3 M KCl. Każdą frakcję soli zatężono 400-krotnie i odsalono przez ultrafiltrację Centriprep i Microcon (Amicon, Beverly, Massachusetts, USA) z odcięciem masy cząsteczkowej 10 000. Frakcje badano pod kątem aktywności TINF przez EMSA. Etap chromatografii anionowymiennej spowodował 15-krotne oczyszczenie i około 40% odzysk. Aktywną frakcję zatężono i poddano SDS-PAGE (15%). Aby zidentyfikować położenie TINF, 2 mm (szerokość) x mm (wysokość) wycinano plastry żelu od krawędzi pasa. TINF eluowano z frakcji każdego kawałka żelu przez mieszanie przez godzinę w temperaturze pokojowej w 25 | jl buforu do wymywania żelu (1% Triton X-100, 20 mM HEPES [pH 7,6], mM EDTA, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF i mg / ml aprotyniny) i poddano analizie EMSA w celu identyfikacji plastra zawierającego TINF. Resztę kawałka żelu zawierającego TINF refrakcjonowano na SDS-PAGE, a pasmo z aktywnością TINF poddano trawieniu tryptycznemu i sekwencjonowaniu aminokwasów. Otrzymano prawie jednorodny TINF o wielkości cząsteczkowej około 30 kDa z odzyskiem większym niż 75%. Analizę sekwencji przeprowadzono w Harvard Microchemistry Facility za pomocą tandemowej spektrometrii masowej (MS / MS) na spektrofotometrze masowym Finnigan LCQ Quadrupole Ion (ThermoQuest, San Jose, Kalifornia, USA). izolacja mRNA i 5 (3/3 (3 – szybka amplifikacja komplementarnych końców. mRNA izolowano przy użyciu oczyszczania z powinowactwa oligo (dT) (zestaw do izolacji mRNA z Boehringer Mannheim). 5. / 3. -Promotowa amplifikacja komplementarnych końców (5. / 3. -RACE) z mRNA z EC ludzkich i bydlęcych została przeprowadzona przy użyciu zestawu od Boehringer Mannheim. Zaprojektowano trzy specyficzne startery dla 5a-RACE, wszystkie odpowiadające zakonserwowanemu regionowi znanych białek Y-box (nr 1, stosowane w reakcji RT, 5 (3-GGTAGTTCTGCTGGTAATTGCG-3 <, n. 2 i 3 stosowany do amplifikacji PCR produktów reakcji RT, 5a-GCGACGTGGATAGCGTCTGTAATGGT-3a i 5a-GATATCGGTCTGC-TGCGTATTTACTGC-3.) [patrz też: herbata czarna właściwości, dieta montignaca przepisy, u bogdana ] [podobne: ciśnienie atmosferyczne a samopoczucie, biedronka świątniki górne, mozga kanaryjska gdzie kupić ]