Skip to content

Mutacja w receptorze leptyny jest związana z zakażeniem Entamoeba histolytica u dzieci ad 8

1 miesiąc ago

753 words

W skrócie, klon embrionalny komórek macierzystych wstrzyknięto do blastocyst C57BL / 6J, a potomstwo założyciela krzyżowano z myszami 129P3 / J. Zwierzęta F1 segregujące dla docelowego allelu Lepr krzyżowano w celu wytworzenia zwierząt 223Q / Q, 223Q / R i 223R / R stosowanych do infekcji E. histolytica. Zwierzęta utrzymywano w warunkach wolnych od specyficznych patogenów na Uniwersytecie Virginia. Wszystkie protokoły zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Pielęgnacji i Użytkowania Zwierząt. Myszy dokładnie monitorowano pod kątem ogólnego samopoczucia; osoby, które zostały uznane za w stanie agonalnym (na pozór chore, poważnie odwodnione i całkowita utrata aktywności) zostały uśmiercone przed planowanym terminem zakończenia, podczas gdy pozostałe zostały uśmiercone w dniu 3 po prowokacji. Mysz ceca zebrano i umieszczono w utrwalaczu Bouina (Sigma-Aldrich) do barwienia H & E. Aby ocenić infekcję, 200 .l zawartości ślepej kału oznaczano dla antygenu amebowego stosując zestaw ELISA E. histolytica II (TechLab) i 300 .l hodowano w kompletnym medium TYI-S-33 przez 5 dni. Porównania statystyczne dotyczące współczynników zakażenia przeprowadzono za pomocą dokładnego testu Fishera; P. 0,05 uznano za znaczące. Pasożyty i inokulacja wewnątrzczaszkowa. Trofozoity do iniekcji dosercowej zostały pierwotnie uzyskane ze szczepu laboratoryjnego HM1: IMSS (ATCC), który kolejno pasażowano przez kątnicę mysia. Zawartość cecala hodowano w pożywce trypsyna-drożdż-żelazo (TYI-S-33) z dodatkiem Diamond Vitamin (JRH Biosciences), surowicy bydlęcej (Sigma-Aldrich) i 100 U / ml penicyliny plus 100 | ig / ml streptomycyny. W przypadku wszystkich donaczyń wewnątrzczaszkowych trofozoity hodowano do fazy logarytmicznej, a 2 x 106 trofozoitów w 150 ul wstrzykiwano śródskórnie po laparotomii, jak opisano wcześniej (36). Barwienie immunohistochemiczne i badanie histopatologiczne. Barwienie immunohistochemiczne dla fosforylowanej Akt i aktywowanej kaspazy-3 przeprowadzono za pomocą zestawu ABC (Vector Laboratories), stosując anty-fosfo-specyficzną Akt (Ser473) (Cell Signaling Technology) i przeciwciało poliklonalne anty-ludzkie / mysie aktywowane kaspazą-3 (R & D Systemy). Aby zmierzyć ilość białka p-Akt, wszystkie sekcje każdej próbki oceniono zgodnie z następującymi kryteriami: 0, jako brak sygnału dodatniego; 1, jako niski, ale wykrywalny sygnał, z częstotliwością mniejszą niż 10% obszaru śluzówki; 2, jako umiarkowany sygnał, z częstotliwościami sięgającymi 10%. 50% obszaru śluzówki; i 3, jako intensywny sygnał o częstotliwości ponad 50%. Próbki odczytano w sposób zaślepiony, a wynik uśredniono ze wszystkich zbadanych sekcji (5. 9 przekrojów na mysz). Do kwantyfikacji apoptozy, zliczono wszystkie aktywowane komórki 3-kappazy-3-pozytywne, a komórki dodatnie z IEC w stosunku do komórek infiltrujących podano średnio jako dodatnie komórki na sekcję. Histologiczny punkt oceny niszczenia / owrzodzenia błony śluzowej był przeprowadzony w sposób zaślepiony, jak wcześniej opublikowano (36, 37): żadne uszkodzenie błony śluzowej nie zostało ocenione jako 0, łagodna erozja powierzchni śluzówki oznaczona jako 1, ogniskowe owrzodzenie lub zaburzona architektura oceniona jako 2, i rozległe błony śluzowe uszkodzenie i rozszerzenie do głębszych struktur ściany jelita jako 3. Ilościowa RT-PCR. Całkowity RNA ekstrahowano z kątnicy myszy przy użyciu zestawu RNeasy Mini (QIAGEN) zgodnie z instrukcją producenta. RNA traktowane DNazą poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA pierwszej nici przy użyciu odwrotnej transkryptazy SuperScript III (Invitrogen Life Technologies). qRT-PCR przeprowadzono z iCycler iQ System (Bio-Rad Laboratories). GAPDH zastosowano jako kontrolę wewnętrzną. W tym badaniu użyto następujących starterów: GAPDH, do przodu: 5a-GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA-3a, odwrotna: 5a-TCACCACCATGGAGAAGGC-3; BcL-2, do przodu: 5a-TGCACCTGACGCCCTTCAC-3a, wsteczny: 5a-AGACAGCCAGGAGAAATCAAACAG-3; cyklina D3, do przodu: 5a-CTGGCCATGAACTACCTGGA-3a, odwrotna: 5a-CCAGGAAATCATGTGCAATC-3 .. Materiały uzupełniające Zobacz dane uzupełniające Podziękowania Dziękujemy dzieciom i ich rodzinom w Mirpur, Dhaka, Bangladeszu za udział w tym badaniu. Uznajemy wgląd i pomoc Joan E. Bailey-Wilson. Praca ta była wspierana przez NIH udziela AI043596 (do WA Petri), R01 AI071373 (do E. Houpt), R01 DK056731 (do MG Myers), R01 DK52431-17 (do RL Leibel) i 5P30 DK26687-29 New York Obesity Research Center, Molecular Biology / Molecular Genetics Core (do RL Leibel i SC Chua Jr.), a po części przez wewnętrzny podział Narodowego Instytutu Badań nad Genomem Człowieka, NIH oraz National Institutes of Allergy and Infectious Disease (do WA Petri) ). Przypisy Konflikt interesów: William A. Petri Jr. ma umowę licencyjną na diagnostykę amebiazy z TechLab Inc .; jednak wszelkie opłaty licencyjne z tej umowy są przekazywane na rzecz Amerykańskiego Towarzystwa Medycyny Tropikalnej i Higieny bez korzyści dla Williama A. Petri Jr. Informacje referencyjne: J Clin Invest. 2011; 121 (3): 1191 1198. doi: 10.1172 / JCI45294.
[patrz też: ciśnienie atmosferyczne a samopoczucie, błonnik witalny gdzie kupić, sprzęt rehabilitacyjny dla dzieci ]
[patrz też: błonnik witalny gdzie kupić, zatańcz ze mną cda, leclerc godziny otwarcia ]