Skip to content

Mutacja w receptorze leptyny jest związana z zakażeniem Entamoeba histolytica u dzieci ad 7

1 miesiąc ago

655 words

Zastosowaliśmy protokół producenta do amplifikacji. Zamplifikowany produkt rozcieńczono 80 .l 1x buforu TE. Próbki ogrzewano do 99 ° C przez 5 minut, a następnie rozcieńczono 100 .l buforu TE. Wybór SNP. Określono SNP w genach LEP i LEPR oraz 10 kb powyżej i poniżej genów. Te tagSNP zostały wybrane przy użyciu oprogramowania SNPbrowser opisującego bazę danych map HapMap (NCBI Build 36) LD. Kryteria wyboru dla tagSNP zostały ustalone na poziomie minimalnego MAF wynoszącego 5% dla populacji HapMap Ceph Utah (CEU). Redundantne SNP (te z r2 = 1) zostały usunięte. Oprócz wyboru tagSNP, SNP uwzględniono dla każdej 0,5 jednostki LDU, aby zapewnić pokrycie dla każdego tagSNP, który może nie genotypować. Te metody połączono w celu wygenerowania końcowej listy SNP. Genotypowanie. Próbki DNA pacjenta pochodziły z krwi pełnej. SNP zostały genotypowane przy użyciu platformy SNPlex (Applied Biosystems). Platforma ta umożliwiła multipleksowanie genotypowania do 48 SNP na test. Genotypowanie ukierunkowanych nsSNP przeprowadzono przy użyciu TaqMan SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems). Ilościowe oznaczenie leptyny i receptora leptyny. Leptynę i rozpuszczalny receptor leptyny badano w surowicy z próbek krwi pobranych od badanych dzieci rano przed pierwszym posiłkiem. Pomiary przeprowadzono w 2008 roku z 141/185 dzieci w wieku od 10 do 13 lat. Leptynę mierzono za pomocą zestawu ELISA Human LEPTIN (Biosource) i receptora leptyny z testem immunologicznym sR Immuno-testu Quantikine Human Leptin (R & D Systems). Metody qRT-PCR. RNA wyizolowano z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej przy użyciu zestawu izolującego RNA PicoPure (Arcturus). Stężenie RNA mierzono za pomocą NanoDrop 1000 (Thermo Scientific) przed odwrotną transkrypcją stosując Superscript II RT (Invitrogen). Ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono z użyciem iCycler (BIO-RAD) i 2 x QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN) o całkowitej objętości reakcji wynoszącej 25 ul. Startery PCR zastosowane dla genu LEPR to Hs_LEPR_1_SG QuantiTect Primer Assay (QIAGEN), który wykrywa receptor leptyny Homo sapiens (LEPR), wariant transkryptu (NM_002303), wariant transkryptu 2 (NM_001003679) i wariant transkryptu 3 (NM_001003680), i HS_LEPR_vb.2_SG QuantiTect Primer Assay (QIAGEN), który wykrywa wariant transkryptu (NM_002303). Szczegółowe informacje o transkryptach są dostępne za pośrednictwem NCBI. Jako kontrole endogenne zastosowano fosforybozylotransferazę hipoksantynową (HPRT1) i izomerazę peptydylopropylową (PPIA). Uzyskane dane skorygowano dla względnej wydajności amplifikacji za pomocą standardowych krzywych, a względne wartości stężenia cDNA standaryzowano i wyrażono proporcjonalnie do częstotliwości ARG / GLN w średniej próbki. Wartości LEPR_1_SG i HS_LEPR_vb.2_SG zostały następnie znormalizowane do średniej PPIA i HPRT1. Nieparametryczną ANOVA (test Kruskala-Wallisa) użyto do porównania 3 grup genotypów dla 2 izoform LEPR przy użyciu GraphPad Prism (wersja 4.0a). Statystyka. Częstości alleli dla SNP oszacowano na podstawie całej kohorty metodą zliczania. Związek alleliczny obliczono za pomocą testu c2 w programie statystycznym Haploview (v4.0), a tylko SNP, które miały wartość P mniejszą niż 0,05 po testach permutacji (10 000 permutacji) uznano za znaczące. Haplotypy i nierównomierność sprzężeń parami oszacowano również w Haploview stosując stały kręgosłup LD (D = 0,80). Genotypowe powiązanie dla każdego SNP porównano pomiędzy osobnikami dla każdej kategorii klinicznej za pomocą c2. Wielkość związku między SNP a występowaniem zakażenia E. histolytica mierzono za pomocą OR, stosując regresję logistyczną, która odzwierciedla prawdopodobieństwo uzyskania określonego wyniku klinicznego z uwagi na obserwowany genotyp. Potencjalne czynniki zakłócające wiek, płeć i obszar w obrębie Mirpur zostały uwzględnione w modelach regresji wielokrotnej logistyki. Permutacje, w których tasiemkowano kategorię przypadku (n = 10 000), obliczano dla prostej analizy regresji logistycznej tylko w celu zminimalizowania błędu typu i przedstawiono te empiryczne wartości P. Wszystkie analizy regresji i Kaplana-Meiera zostały obliczone przy użyciu oprogramowania Stata (wersja 10.0; StataCorp). Ryzyko związane z przypisaniem populacji obliczono za pomocą równania 1. a allG (A G / ORG), gdzie ORG reprezentuje iloraz szans, a G oznacza przypadki z genotypem (tj. AG / GG). Do analizy wykorzystano pakiet statystyczny STATA v9.0. P <0,05 uznano za znaczący. Model zwierzęcy. Myszy niosące humanizowany allel LEPR w kodonie 223 wytworzono zgodnie z wcześniejszym opisem (22). [więcej w: łowisko u bogdana, ciśnienie atmosferyczne a samopoczucie, błonnik witalny gdzie kupić ] [patrz też: biustonosze na duzy biust, polipy woreczka żółciowego, na czym polega rezonans magnetyczny ]