Skip to content

Trombina aktywuje białko wiążące Y-Box (białko wiążące DNA B) w komórkach śródbłonka czesc 4

1 miesiąc ago

505 words

Bydlęce EC hodowano na szklanych płytkach powleczonych fibronektyną, transfekowano konstrukty GFP-dbpB, jak już tu opisano, utrwalono w 4% paraformaldehydzie 36 godzin po transfekcji, permeabilizowano 0,3% Triton-X, traktowano RNazą A, przemyto i osadzono w medium montażowe. Jądra barwiono jodkiem propidyny. Wyniki Identyfikacja TINF jako dbpB. TINF został oczyszczony do prawie homogeniczności, jak tu właśnie opisano. Próba sekwencjonowania końca NH2 doprowadziła do znalezienia zablokowanego końca. TINF następnie poddano trawieniu trypsynowemu i kilka piki oczyszczonych metodą HPLC zsekwencjonowano za pomocą tandemowej spektrometrii mas. Otrzymano cztery sekwencje peptydów (nr 1: NDTKEDVFVHQTAIK; nr 2: NGYGFINR, nr 3: GETVEFDVVEGEK i nr 4: EDVFVHQTAIK), ujawniając, że ten region TINF miał całkowitą homologię z wieloma członami Y-boxa. wiążąca rodzina białek. Białka te są wysoce konserwatywne od E. coli do człowieka, przy czym poszczególni członkowie rodziny różnią się jedynie krótkimi regionami końca NH2 i końca COOH, co ma związek z rozpoznawaniem sekwencji DNA i RNA. Aby określić, czy wiele białek wiążących się z Y-Box uległo ekspresji w hodowanych EC, wyizolowaliśmy mRNA z ludzkiej żyły pępowinowej i bydlęcych EC a wykonaliśmy analizę 5 (3 i 3A-RCE. Analiza 3. -RACE ludzkiego mRNA EC, przy użyciu swoistych starterów odpowiadających sekwencjom w wysoce konserwatywnej domenie (zasadniczo identycznych we wszystkich białkach wiążących Y-box), dała jako jedyny produkt kompletną końcową 3. DprpB. 5A -RACE dało w rezultacie częściową końcową sekwencję 5. Tego samego mRNA, a mianowicie DBPB. Liczne analizy 5 (3 i 3A-RCE z klonowaniem i sekwencjonowaniem wielu cDNA dały wynik braku dodatkowych cDNA białka wiążącego białka Y wyrażanych przez ludzkie EC lub EC bydła. W EC bydlęcego wykryto homolog ludzkiego DBPB w odróżnieniu od jedynego zgłoszonego białka bydlęcego typu Y EF1A. Translokacja DBPB do jądra EC po stymulacji trombiną. Białko fuzyjne GFP-dbpB przejściowo eksprymowane w bydlęcych EC zostało zatrzymane w cytoplazmie (Figura 1a). Po stymulacji trombiną część białka fuzyjnego w EC przeniesiono do jąder (Figura 1b). Aby ocenić ilościowo tę obserwację, przeprowadziliśmy analizę FACS jąder izolowanych z niestymulowanych i stymulowanych trombiną EC. Zarówno liczba jąder zawierających GFP, jak i średnia intensywność fluorescencji na jądro wzrosła ponad trzykrotnie w odpowiedzi na stymulację trombiną (Figura 1c). Ryc. 1. Lokalizacja pełnej długości dbpB w komórkach śródbłonka z i bez leczenia trombiną. Bydlęce EC przejściowo transfekowano cDNA kodującym białko fuzyjne pełnej długości DBPB i białko zielonej fluorescencji, jak opisano w Methods. (a) Bez stymulacji trombiną. (b) Po 2-godzinnej stymulacji trombiną (10 U / ml). Jądra barwiono jodkiem propidyny. (c) Kwantyfikacja FACS tego eksperymentu. Jądra izolowano z niestymulowanych i stymulowanych trombiną EC (10 U / ml przez 2 godziny) i analizowano za pomocą FACS. Jednostki arbitralne stosuje się zarówno dla liczby jąder zawierających GFP, jak i dla średniej intensywności fluorescencji jąder (n = 10, P <0,01). Rozszczepienie proteolityczne dbpB podczas aktywacji. Donoszono, że pozorny rozmiar białka DBPB i innych białek typu Y w SDS-PAGE wynosi 46 . 56 kDa (34 . 40). Przewidywana wielkość z sekwencji cDNA wynosi 35 kDa z różnicą w wielkościach wyjaśnioną przez możliwą potranslacyjną modyfikację dbpB lub nietypowy rozkład ładunku w białku (34). Transkrybowaliśmy i przetłumaczyliśmy dbpB in vitro, a znakowana 35S dbpB, która została wytworzona, wykazywała pozorny rozmiar cząsteczkowy około 48 49 49 kDa w SDS-PAGE (Figura 2a). Aktywna forma DBPB wiążąca DNA, którą oczyszczaliśmy z EC traktowanych trombiną, miała rozmiar cząsteczkowy około 30 kDa metodą SDS-PAGE. Przeciwciało wytworzone przeciwko 15 aminokwasom na końcu COOH w DBPB rozpoznało w lizatach komórkowych około 48- do 49-kDa DBPB (Figura 2b), jak również in vitro. Translokowane DBPB (dane nie pokazane); jednakże nie rozpoznało aktywnej (wiążącej DNA) postaci DBKB o 30 kDa. Te wyniki sugerują, że aktywna forma była krótsza niż DBpB nie wiążąca DNA, prawdopodobnie w wyniku proteolitycznego rozszczepienia COOH-końca DBPB podczas procesu aktywacji wewnątrzkomórkowej. Możliwość ta była poparta faktem, że niektóre ekstrakty z EC traktowanych trombiną, ale nigdy nie kontrolowały ekstraktów, zawierały peptyd o około 18-19 kDa, który był rozpoznawany przez przeciwciało dbpB (Figura 2b). Suma rozmiarów tego peptydu i aktywowanej dbpB (30 kDa) była zbliżona do wielkości DBPB o pełnej długości (48. 49 kDa) [więcej w: na czym polega rezonans magnetyczny, biustonosze na duzy biust, biedronka świątniki górne ] [patrz też: łowisko mąkolno, łowisko u bogdana, łowisko u roberta ]