Skip to content

Trombina aktywuje białko wiążące Y-Box (białko wiążące DNA B) w komórkach śródbłonka ad 7

1 miesiąc ago

787 words

Chociaż w tym czasie wiele się nauczyło o receptorach na powierzchni komórki i mediatorach odpowiedzialnych za wczesną transkrypcję sygnałów odpowiedzialnych za działanie trombiny na komórki, zdarzenia jądrowe wywołane przez trombinę pozostają słabo zdefiniowane. Wcześniej rozszerzyliśmy obserwację innych o to, że gen łańcucha PDGF B jest indukowany przez trombinę (8 (11) poprzez identyfikację zarówno 9-bp ThRE w promotorze łańcucha PDGF B, jak i TINF, który wiąże ten pierwiastek ( 12). Mutacje w zaledwie czterech zasadach w tym regionie prowadziły do utraty zarówno wiązania TINF z DNA, jak i indukowanej trombiną transkrypcji kierowanej przez promotor PDGF B. Oczyszczanie i sekwencjonowanie aminokwasów pokazują teraz, że to indukowane trombiną białko należy do rodziny białek Y-box, która jest najbardziej ewolucyjną konserwowaną rodziną znanych białek wiążących DNA. Białka typu Y-box mają wysoce konserwowaną domenę wiążącą kwas nukleinowy (prawie identyczną z domeną zimnego szoku w białkach wiążących białka Y-box) i krótką zmienną domenę końca NH2 i domen COOH-końcowych, które uważa się za uczestniczące w rozpoznawaniu sekwencji DNA. . Test 5 (3/3 (3CERA ujawnił, że TINF w ludzkich EC oznacza DBBB, a w EC bydła jest bydlęcym analogiem DBPB, odmiennym od EF1A, wcześniej zgłoszonym białkiem bydlęcym typu Y (42). Wykazano, że DbpB odgrywa rolę w ekspresji głównej zgodności tkankowej IA. gen (20, 43), a także GM-CSF (21). Przewidywana wielkość w oparciu o sekwencję DNA dla dbpB wynosi około 35 kDa. Jednak kilka grup badaczy zauważyło, że to białko, podobnie jak inne białka Y-box, migrują w SDS-PAGE o pozornej wielkości 46 50 50 kDa (34 40 40). Uważa się, że różnica w przewidywanych i widocznych rozmiarach jest wynikiem modyfikacji posttranslacyjnej lub nietypowego rozkładu ładunku w białkach Y-box (34). Przeprowadziliśmy transkrypcję i translację DBPB in vitro, a pozorna wielkość białka w SDS-PAGE wynosi 48-49 kDa. Biorąc pod uwagę, że białka nie są modyfikowane potranslacyjnie w systemie translacji transkrypcji in vitro, różnicę wielkości przewidywanych i pozornych należy przypisać strukturze DBPB. Aktywna dbpB w ekstraktach z EC traktowanych trombiną ma rozmiar 30 kDa metodą SDS-PAGE. Uważamy, że różnica w wielkości między nieaktywną i aktywowaną trombiną DBPB jest wynikiem rozszczepienia proteolitycznego, które występuje podczas aktywacji. Nasze wyniki z przeciwciałem skierowanym przeciwko COOH-końca DBPB wspiera ten model; przeciwciało rozpoznaje tylko nieaktywną formę białka 48- do 49-kDa i nie rozpoznaje aktywnej krótkiej postaci, co sugeruje, że część końcowa COOH z DBPB jest cięta podczas aktywacji. Ponadto niestabilny peptyd o masie od 18 do 19 kDa rozpoznawany przez przeciwciało przeciw końcowi COOH o dppB może często być wykryty w ekstraktach EC stymulowanych trombiną. Wykazano, że część końcowa COOH innego członka rodziny Y-box, YB-1, zawiera domenę retencyjną cytoplazmatyczną (41). Gdy cDNA YB-1 pełnej długości zostało transfekowane do komórek, jego produkt został znaleziony głównie w cytoplazmie; mając na uwadze, że gdy skrócona forma YB-1 ulegała ekspresji w tych samych komórkach, produkt został szybko przeniesiony do jądra. Obserwowaliśmy tę samą dystrybucję komórkową dla dbpB i jej skróconej formy. Skrócona dbpB poddawana koekspresji w bydlęcych EC z konstruktem promotorowym lucyferazy łańcucha B PDGF nie zwiększała znacząco aktywności transkrypcyjnej, ani samodzielnie, ani w obecności niskiego stężenia trombiny (dane nie przedstawione). Istnieją co najmniej dwa wyjaśnienia tego negatywnego wyniku. Pierwszym z nich jest to, że aktywowana DBPB wiąże DNA, ale wymaga dodatkowego indukowanego przez trombinę czynnika jądrowego do indukcji transkrypcji. Istnieje wiele takich przykładów w literaturze, w których dwa lub nawet trzy czynniki transkrypcyjne muszą być wyrażane w kombinacji w celu stymulacji aktywności transkrypcyjnej. Zatem aktywowana dbpB może być konieczna, ale niewystarczająca, do indukcji trombiny w transkrypcji łańcucha PDGFB. Drugim możliwym wyjaśnieniem jest to, że krótka forma dbpB, którą stosowaliśmy w naszych badaniach, nie jest prawdziwą długością aktywowanego DBPB in vivo. Dokładne miejsce cięcia jest nieznane, ponieważ oczyszczona, aktywowana DBPB jest terminalnie zablokowana NH2. Krótka dbpB, którą pierwotnie używaliśmy została wybrana, ponieważ była w przybliżeniu prawidłowej wielkości w SDS-PAGE i wiązała oligonukleotyd trombiny-odpowiedź; jednakże region wokół tego przypuszczalnego miejsca cięcia jest bogaty w naładowane i aromatyczne aminokwasy, których obecność lub brak może spowodować dramatyczne zmiany w obciętych właściwościach DBPB (np. translokacja do jądra komórkowego, aktywność wiązania DNA, ruchliwość elektroforetyczna)
[hasła pokrewne: ciśnienie atmosferyczne a samopoczucie, mozga kanaryjska gdzie kupić, prohormony skutki uboczne ]
[przypisy: na czym polega rezonans magnetyczny, błonnik witalny gdzie kupić, zatańcz ze mną cda ]