Skip to content

Trombina aktywuje białko wiążące Y-Box (białko wiążące DNA B) w komórkach śródbłonka ad 6

1 miesiąc ago

768 words

Jako kontrolę zastosowano pusty wektor pcDNA3 w podobnej reakcji. Wyciągi cytosolowe przygotowano z nietraktowanych i stymulowanych trombiną EC, jak opisano. EMSA przeprowadzono z użyciem oligonukleotydu sekwencji ThRE lub konsensusowego Y jako sondy (b). Ta sama konsensusowa sonda Y-box została użyta do wykrywania pełnej długości DBPB w jądrowych ekstraktach EC, a kompleks był supershifted z przeciwciałem anty-DBB. Kontrola, transkrypcja in vitro i reakcja translacji przeprowadzana przy użyciu pustego wektora pcDNA3 (a) lub ekstraktów cytosolowych i jądrowych z nietraktowanych EC (b); skrócone DBPB, skrócone (207 pz aminokwasów) DBPB transkrybowane i tłumaczone in vitro; trombina, ekstrakt z EC stymulowany trombiną (10 U / m przez 2 godziny); kontrola + Ab, ekstrakt jądrowy z nietraktowanych EC preinkubowanych z surowicą odpornościową przeciwko COOH-końca DBPB o pełnej długości przed reakcją wiązania z konsensusową znakowaną radioaktywnie Y-box; ThRE, sonda ThRE stosowana w EMSA; Y-box SS, sensowna jednoniciowa konsensusowa sonda Y-box stosowana w EMSA; Y-box DS, dwuniciowa sonda konsensusowa Y-box; cytosolic, ekstrakt cytosolowy; jądrowy, ekstrakt jądrowy. Odfosforylowanie białek tyrozyny w aktywacji DBBB. Fosfataza alkaliczna niespecyficznie defosforyluje białka, odszczepiając fosforany zarówno z reszt tyrozynowych, jak i reszt seryny / treoniny. Gdy ekstrakty cytosolowe wytworzone z niestymulowanych EC ludzkich lub bydlęcych inkubowano z fosfatazą alkaliczną (20 U / ml) przez 30 minut w 37 ° C, wykryto nową aktywność wiązania DNA przez EMSA. Białko, które zostało odkryte przez inkubację z alkaliczną fosfatazą wykazywało taką samą mobilność elektroforetyczną i właściwości wiązania DNA jak aktywowana dbpB (dane nie pokazane). Aby dalej przetestować aktywność fosfatazy w aktywacji dbpB przez trombinę, zastosowaliśmy inhibitory aktywności fosfatazy alkalicznej, białka seryno / treoninowego fosfatazy i białka fosfatazy tyrozynowej (PTP). Wstępne traktowanie EC pochodzenia ludzkiego lub bydlęcego dwoma inhibitorami fosfatazy alkalicznej, lewamizolu i tetramizolu, nie zapobiegło aktywacji dbpB przez trombinę (dane nie przedstawione). Inhibitory sebina / treonina fosfatazowe kwas okadaikowy (10 .M przez 2 godziny) (dane nie pokazane) i fluorek sodu (500 .M przez godzinę) (figura 5a) także nie zapobiegły aktywacji DBPB. Dwa dobrze udokumentowane, chemicznie różne inhibitory aktywności PTP zostały użyte do wstępnej obróbki EC przed stymulacją trombiną: wanadanem sodu (50. 500. M przez 30 minut) i tlenkiem fenyloaminy (PAO; 1. 50. M przez 45 minut). Żaden z tych środków nie wykazywał działania cytotoksycznego ani istotnie zmniejszał aktywność trombiny. Oba inhibitory całkowicie uniemożliwiły aktywację dbpB, jak pokazano w EMSA (Figura 5a), co sugeruje udział PTP w aktywacji DBPB. Wstępne traktowanie ludzkich EC za pomocą wanadanu sodu lub PAO również zapobiegało indukcji poziomu mRNA łańcucha B PDGF po leczeniu trombiną (Figura 5b). W komplementarnych doświadczeniach bydlęce EC przejściowo transfekowano plazmidem zawierającym gen reporterowy lucyferazy pod kontrolą fragmentu promotorowego łańcucha B PDGF B o długości 400 pz. Wstępne traktowanie PAO lub wanadanem sodu zapobiegło indukowanej przez trombinę transkrypcji genu reporterowego (Figura 5c). Figura 5 Wpływ inhibitorów fosfatazy tyrozynowej na aktywację transkrypcji łańcucha pB dbpB i PDGF. (a) Wpływ wanadanu sodu (Na3VO4) i fluorku sodu (NaF) na aktywację DBPB przez trombinę. EC były wstępnie traktowane Na3VO4 lub NaF (400. M przez 30 minut), a następnie stymulowane trombiną (10 U / ml przez 2 godziny). EMSA przeprowadzono zgodnie z opisem w Methods. Kontrola, ekstrakt z nietraktowanych EC; Thr, ekstrakt z EC stymulowany trombiną. (b) Wpływ wanadanu sodu (Na3VO4) i tlenku fenyloarynowego (PAO) na mRNA łańcucha bocznego PDGF B indukowanego przez trombinę w EC. EC wstępnie traktowano Na3VO4 lub PAO, a następnie stymulowano trombiną (10 U / ml przez 6 godzin). Całkowity RNA wyekstrahowano za pomocą odczynnika Trizol i przeprowadzono hybrydyzację Northern, stosując jako sondę łańcuch cDNA PDGF B lub cDNA GAPDH. (c) Wpływ inhibitorów PTP na indukowaną trombiną transkrypcję kierowaną przez promotor łańcucha B PDGF. EC bydlęce przejściowo transfekowano (jak opisano w Metodach) genem reporterowym lucyferazy pod kontrolą fragmentu promotora łańcucha B PDGF o wielkości 400 pz w wektorze pGL3-Basic (Promega Corp.). Wstępną obróbkę (30 minut) inhibitorami PTP (400 .M Na3VO4 lub 200 nM PAO) rozpoczęto po 6-godzinnej inkubacji transfekcyjnej. Lizaty przygotowano po 15-godzinnej inkubacji z trombiną (10 U / ml). Aktywność lucyferazy normalizowano względem aktywności p-galaktozydazy pochodzącej z kotransfekowanego cDNA pSV p-galaktozydazy. Dyskusja Rola trombiny jako induktora ekspresji genów w EC i innych typach komórek została dobrze udokumentowana przez wielu badaczy w ostatniej dekadzie.
[przypisy: herbata czarna właściwości, sezam właściwości lecznicze, leclerc godziny otwarcia ]
[podobne: sezam właściwości lecznicze, biustonosze na duzy biust, polipy woreczka żółciowego ]