Skip to content

Trombina aktywuje białko wiążące Y-Box (białko wiążące DNA B) w komórkach śródbłonka ad 5

1 miesiąc ago

779 words

Fragment 18 kDa wytworzony podczas aktywacji DBPB jest najwyraźniej niestabilny w komórce lub w procesie przygotowywania ekstraktu, ponieważ nie zawsze jest wykrywany pomimo. Koktajlu. inhibitorów proteazy. Figura 2 Przeciwciało skierowane na koniec COOH w DBPB rozpoznawało białko o wielkości 49 kDa w lizatach EC, jak również w teście in vitro translacji DBPB. (a) W translokacji in vitro, DBPB pełnej długości znakowanej [35S] metioniną wykazywał pozorny rozmiar 49 kDa w SDS-PAGE (8% żel). Skrócona dbpB miała widoczną wielkość 30 kDa (taką samą wielkość jak aktywna dbpB znajdowana w ekstraktach EC stymulowanych trombiną). (b) Western blot cytosolowych ekstraktów ludzkich EC przy użyciu przeciwciała skierowanego do COOH-końca DBPB. W przypadku braku stymulacji wykryto białko o masie 49 kDa. Stymulacja EC za pomocą trombiny (10 U / ml przez 2 godziny) spowodowała pojawienie się nowego prążka o około 19 kDa, przypuszczalnie COOH-koniec DBPB strawionego podczas procesu aktywacji. Użyliśmy transkrypcji / translacji in vitro do przygotowania skróconego DBPB o wartości około 30 kDa w SDS-PAGE (Figura 2a). Skrócenie dokonano przez wprowadzenie kodonu stop po 207 aminokwasach. Inni wcześniej wykazali, że odpowiednie skrócenie białka YB-1 spowodowało jego lokalizację w jądrze w porównaniu z białkiem pełnej długości, które pozostało głównie w cytoplazmie (41). Podobnie, gdy wyrażaliśmy w EC bydlęce białko fuzyjne GFP i skróconą DBPB, umiejscowiono je w jądrze, inaczej niż DBPB o pełnej długości (Figura 1a i dane nie pokazane). Zbadaliśmy właściwości wiązania DNA obciętej dbpB w teście in vitro i porównaliśmy je do aktywowanej dbpB w ekstraktach z EC stymulowanych trombiną. Skrócona DBPB związała się z oligonukleotydem odpowiadającym ThRE promotora łańcucha B PDGF i wykazywała ruchliwość elektroforetyczną bardzo podobną do DBPB aktywowanej trombiną oczyszczonej z EC zarówno w SDS-PAGE po sieciowaniu w ultrafiolecie (Figura 3a) i w EMSA (rysunek 3b). Rysunek 3 Porównanie skróconego DBPB do TINF. Skrócone cDNA DBPB wytworzono przez wprowadzenie kodonu stop po pozycji 621 i subklonowanie do wektora pcDNA3. Skrócone cDNA DBPB poddano transkrypcji i translacji in vitro i poddano SDS-PAGE (żel 8%) po sieciowaniu z sondą DNA (a) i EMSA (b). (Oligonukleotyd ThRE zastosowano jako sondę w obu testach). pcDNA3, pusty wektor pcDNA3 stosowany jako kontrola reakcji transkrypcji i translacji in vitro; skrócone DBPB, skrócone cDNA DBPB w wektorze pcDNA3 stosowane do reakcji translacji in vitro; contro, ekstrakt z niestymulowanych EC; trombina, ekstrakt z EC stymulowanych trombiną (10 U / ml przez 2 godziny). Pojawienie się krótkiej postaci DBPB w lizatach EC stymulowanych trombiną nie wynikało z rozszczepienia tego białka przez trombinę podczas przygotowywania lizatu. We wszystkich doświadczeniach duży nadmiar inhibitora trombiny został dodany do komórek przed lizą, a czas zerowy. kontrole nie wykazały żadnej aktywnej dbpB. Po drugie, nie wykryliśmy krótkiej dbpB po inkubacji lizatów cytozolowych z kontrolnych EC z niesyconymi EC, które były stymulowane trombiną. Aby znaleźć innych agonistów EC zdolnych do aktywacji dbpB, przetestowaliśmy serię środków, o których wiadomo, że aktywują niektóre z tych samych wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych, takich jak trombina. Stymulacja EC ze stabilnym analogiem tromboksanu A2 U46,601 (10 (3M i 100 (MM), czynnik aktywujący płytki (100 nM i 10 M M), histamina (10 M M i 100 M M), TNF-a (10 ng / ml), IL-1 (20 ng / ml), TGF-a (25 ng / ml), bFGF (10 ng / ml), EGF (20 ng / ml) lub IFN-y. (100 ng / ml) nie aktywowało dbpB w EC (dane nie pokazane). Inne proteazy serynowe testowano również pod kątem ich zdolności do aktywacji dbpB w EC. Komórki inkubowano z trypsyną (0,05. 5 U / ml), katepsyną G (0,01 U / ml), czynnikiem Xa (0,2. 11 U / ml) i plazminą (0,1 U / ml), a następnie preparatem wyciągu cytosolowego i EMSA. z oligonukleotydem ThRE. Żadna z tych proteaz nie aktywowała DBPB w EC (dane nie pokazane). Specyficzność wiązania DNA obciętej dbpB. Zarówno in vitro, jak i skrócone DBPB i DBPB aktywowane trombiną w ekstraktach cytosolowych i jądrowych EC nie zdołały utworzyć kompleksu z oligonukleotydem konsensusowym Y-box (odwrócone pudełko CCAT) w EMSA (Figura 4, aib). Ta sama konsensusowa sonda Y-box została rozpoznana przez pełnej długości DBPB obecną konstytutywnie w ekstraktach jądrowych, a kompleks ten był supershifted przez antyserum anty-DBB (Figura 4b). Figura 4 Właściwości wiążące trombinę DBPB wiążące trombinę. Skrócony cDNA DBPB odpowiadający rozmiarem dbpB aktywowanej trombiną z ekstraktów EC został transkrybowany i poddany translacji in vitro, a mieszaninę reakcyjną użyto do EMSA z ThRE, Y-box jednoniciową lub podwójną Y-box. skondensowany oligonukleotyd konsensusowy jako sonda (a)
[hasła pokrewne: mozga kanaryjska gdzie kupić, leclerc godziny otwarcia, prohormony skutki uboczne ]
[patrz też: u bogdana, lowisko zgoda, sprzęt rehabilitacyjny dla dzieci ]