Skip to content

IFN- chroni krótkoterminowe linie komórek raka jajnika przed lizy CTL poprzez mechanizm zależny od CD94 / NKG2A cd

1 miesiąc ago

692 words

Starterem sensownym był 5. -GGGACACCGCACAGATTTT-3. z egzonu 2, a antysensownym starterem był 5 (3 -CTCAGAGGCATCATTTGACTTTT-3. z eksonu 3, prowadząc do amplikonu o długości 254 bp. Sonda TaqMan (FAM-AGAGCGAGGCCGGGTCTCA-TAMRA) (CyberGene AB, Huddinge, Szwecja) została zaprojektowana tak, aby obejmowała powiązane ujścia egzonów (eksony 2 i 3) i była oznaczona niebieskim 6-FAM (CyberGene AB) jako reporter i TAMRA (CyberGene AB ) jako wygaszacz. Specyficzność starterów potwierdzono przez klonowanie produktu PCR do pGEM-T Easy Vector (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA), a następnie sekwencjonowanie z użyciem starterów T7 i SP6 (CyberGene AB). Względne oznaczenie ilościowe ekspresji genu HLA-E obliczono przy użyciu ekspresji genu p-aktyny jako kontroli endogennej, jak opisano wcześniej (29). Analiza Western blot HLA-G. Wszystkie procedury przeprowadzono przy użyciu układu do elektroforezy Multiphor II i homogenicznych żeli wstępnie uformowanych ExcelGel SDS (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey, USA). Komórki hodowane w pełnej pożywce lub w obecności IFN-y (500 IU / ml) przez 48 godzin w 37 ° C osadzono przez odwirowanie i poddano lizie w buforze do próbek do elektroforezy. Podwielokrotności całkowitych lizatów komórkowych odpowiadających 5 x 104 komórek rozdzielano przez SDS-PAGE, a następnie przenoszono na membrany nitrocelulozowe (Millipore AB, Sundbyberg, Szwecja). Membrany zablokowano w PBS zawierającym 5% mleka i 0,1% Tween-20 i sondowano mysim mAb anty-HLA-G MEM-G / (EXBIO Praha AS, Praha, Czechy) w stężeniu .g / ml. . Po inkubacji z drugorzędowym anty-mysim Ab skoniugowanym z peroksydazą chrzanową (Amersham Pharmacia Biotech), membrany intensywnie przepłukano i reakcję zwizualizowano przez wzmocnioną chemiluminescencję zgodnie z protokołem producenta (Amersham Pharmacia Biotech). Równe obciążenie całkowitymi lizatami komórek z nietraktowanych i traktowanych IFN-a śledzono cele za pomocą analizy Western p-aktyny za pomocą blottingu mysiego mAb anty-aktyny (klon AC-74) zakupionej od Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri , USA). Ab. I cytometria przepływowa. Zastosowano następujące mAb: 87G (antyAHLA-G1) był uprzejmie dostarczony przez D. Geraghty (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, Washington, USA). HP3D9 (anty-CD94) został dostarczony przez M. Lopez-Botet (Uniwersytet Pompeu Fabra, Barcelona, Hiszpania). Z199 rozpoznaje hamujący heterodimer CD94 / NKG2A i został wcześniej opisany (30). DAK-G05 (kontrola izotypowa IgG2a), UCHT1 (anty-CD3), DK23 (anty-CD5), TUK4 (anty-CD14), DJ130 (anty-CD16), MOC-1 (anty-CD56) i R- skoniugowane z króliczymi anty-mysimi IgG skoniugowane z fikoerytryną skoniugowano z DAKOPATTS AB (Glostrup, Dania). Sprzężony z FITC anty-nabłonkowy antygen Ber-EP4 pochodził z DAKOPATTS AB. Hybrydomy HB-95 (anty-HLA-A, -B, -C), HB-164 (anty-HLA-A11) i HB-54 (anty-HLA-A2) zakupiono z American Type Culture Collection. Barwienie immunofluorescencyjne przeprowadzono stosując standardowe protokoły. W celu barwienia HLA-G świeżo izolowanych komórek raka jajnika uwzględniono dodatkowy etap blokowania receptora Fc. Komórki inkubowano przez godzinę w 4 ° C z 10% surowic ludzkich AB. Dopasowane izotypowo przeciwciała Ab były stosowane jako kontrola negatywna we wszystkich barwieniach. Komórki analizowano na cytometrze przepływowym FACScan (Becton, Dickinson and Co., San Jose, California, USA). Testy cytotoksyczności i eksperymenty blokujące. Przeprowadzono standardowe testy uwalniania 51Cr. W skrócie, komórki docelowe, nietraktowane lub traktowane IFN-a przez 48 godzin znakowano Na51CrO4 (0,1 CiC / 106 komórek; Amersham Pharmacia Biotech) w 37 ° C przez godzinę. W celu rozpoznania specyficznego dla peptydu, cele inkubowano z (Ig / ml peptydu podczas znakowania. Po intensywnym przemyciu, komórki docelowe inkubowano z efektorami przy różnych stosunkach efektor-do-docelowy w trzech powtórzeniach przez 4 godziny w 37 ° C. Supernatanty zebrano i radioaktywność określono przy użyciu. licznik (Wallac AB, Upplands Väsby, Szwecja). W eksperymentach blokowania komórki efektorowe wstępnie inkubowano z 10 (ag / ml mAb MOC-1 (anty-CD56) lub HP3D9 (anty-CD94) w 4 ° C przez 30 minut przed dodaniem do znakowanych komórek docelowych w 4 -często przeprowadzany test uwalniania 51Cr. Wyniki IFN-y chroni komórki nowotworowe przed lizą za pomocą CTL. Ocenialiśmy ogólną zdolność krótkoterminowych pierwotnych linii komórek nowotworowych do pełnienia funkcji docelowych dla funkcji efektorowych immunologicznych za pośrednictwem CTL po IFN-y. leczenie. W tym celu wykorzystano komórki T CD8 + specyficzne wobec HLA klasy I, rozpoznające cele bez względu na endogenne przetwarzanie i prezentację jednego określonego epitopu. Nieoczekiwanie, OVAC 16 traktowany IFN-y (który jest HLA-A11 +) był chroniony przed lizą przez alloaktywny klon komórek T CD8 + HLA-A11, KV109 (P = 0,01, Figura 1a).
[hasła pokrewne: leclerc godziny otwarcia, u bogdana, dieta montignaca przepisy ]
[hasła pokrewne: prohormony skutki uboczne, łowisko mąkolno, łowisko u bogdana ]