Skip to content

IFN- chroni krótkoterminowe linie komórek raka jajnika przed lizy CTL poprzez mechanizm zależny od CD94 / NKG2A ad

1 miesiąc ago

725 words

Ta ochrona była zależna od zaangażowania hamujących receptorów CD94 / NKG2A ulegających ekspresji na komórkach efektorowych. IFN-. stwierdzono, że leczenie OVAC zwiększa ekspresję mRNA HLA-E, a dane przedstawiono jako wspierające peptyd sygnałowy pochodzący z sekwencji liderowej HLA-G (Gsp) w zabezpieczonej przez IFN-. ochronie OVAC z lizy CTL. Metody Linie komórkowe. Wodobrzusze zebrano podczas pierwotnej operacji u pacjentów z podejrzeniem raka jajnika. Rozpoznanie ustalono na podstawie badania histologicznego próbek nowotworu. Wszystkie były nabłonkowymi rakami jajnika z wyjątkiem jednego, który był guzem jajowodu. Żaden z pacjentów nie był wcześniej leczony radioterapią lub chemioterapią. Komórki nowotworowe wyizolowano jak opisano uprzednio (24) i hodowano przez 2. 4 tygodnie w kompletnej pożywce, składającej się z modyfikowanej Ducellco. S Medium Iscove. (Life Technologies Inc., Gaithersburg, Maryland, USA) uzupełnionej 5. 10% ciepłem. -inaktywowany FCS, 2 mM L-glutaminy, 100 IU / ml penicyliny i 100 .g / ml streptomycyny (Life Technologies Inc.). OVAC scharakteryzowano jako komórki nowotworowe albo przez ekspresję markera nabłonka Ber-EP4 albo przez brak ekspresji markerów monocytów i limfocytów CD3, CD5, CD14, CD16, CD19 i CD56 (25). W niektórych przypadkach sortowanie FACS komórek pozytywnych pod względem Ber-EP4y przeprowadzono w celu wzbogacenia komórek nowotworowych. Przed eksperymentami komórki nowotworowe traktowano 500 IU / ml IFN-y. (Boehringer Ingel-heim International GmbH, Ingelheim, Niemcy) przez 48 godzin w kompletnym medium. Hodowle limfocytów związane z nowotworem (TAL) zostały ustalone z puchliny brzusznej przez pierwsze oddzielenie komórek przy użyciu Ficoll-Hypaque (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Szwecja), a następnie hodowanie ich w AIM-V (Life Technologies Inc., Paisley, Zjednoczone Królestwo) suplementowany 100 IU / ml IL-2 (PeproTech Inc., Rocky Hill, New Jersey, USA). K562 jest ludzką linią komórkową ludzkiej HLA klasy I ujemnej erytroleukemii, która została dostarczona przez G. Nolana (Stanford University, Palo Alto, California, USA). DFW i CKMel-1 są liniami komórek czerniaka, które zostały ustanowione w Laboratorium Terapii Immunologicznej i Genowej w Karolinska Institutet. C1R / A11 jest transfektantem HLA-A11 linii limfoblastoidalnej C1R (LCL), która ma delecję w genie HLA klasy I. Linia komórkowa raka jajnika Caov-4 i linia komórkowa raka sutka MDA 231 pochodziły z American Type Culture Collection (Rockville, Maryland, USA). Ludzka niska LCL 721,2121 HLA klasy I była transfekowana HLA-G1 w celu wytworzenia linii komórkowej 721.221 / G1. Oba zostały opisane wcześniej (26). Linie i klony CTL. Klon CTK ograniczony CD8 + HLA-A11 . specyficzny dla peptydu IVTDFSVIK (IVT), pochodzący z jądrowego antygenu 4 Epstein-Barr (EBNA4), wytworzono przez stymulację PBMC od dającego HLA-A11P pozytywnego dawcę z autologicznym ekspresją LCL. peptyd IVT i był wcześniej scharakteryzowany (27). Klon CTL swoisty dla HLA-A11 . wytworzono przez stymulację PBMC od donora negatywnego pod względem HLA-A11 z napromieniowaną LCLA HLA-A11. Swoistość tego klonu była wielokrotnie testowana na panelu HLA-A11 + i HLA-A11. LCL i blastach fitohemaglutyninowych, a także w liniach komórkowych C1R i C1R / A11. Klony CTL (klon 2 HA-BK i klon 8) i linie CTL (369-11 i 369-26) rozpoznające HLA-A2 wytworzono przez stymulowanie komórek PBMC od dawców ujemnych pod względem HLA-A2 z napromieniowanymi PBMC dodatnimi pod względem HLA-A2p. . RF1 jest poliklonalną reaktywną wobec nowotworu linią CTL, która rozpoznaje OVAC 19 w sposób ograniczony przez MHC klasy I i nie wykazuje aktywności cytolitycznej względem K562, C1R, C1R / A2 lub 721,211. HLA-G sekwencja liderowa peptyd i eksperymenty pulsowania peptydów. Gsp (VMAPRTLFL) zakupiono od Research Genetics (Huntsville, Alabama, USA). Nieleczone OVAC inkubowano z Gsp lub peptydem kontrolnym w 26 ° C przez 15-20 godzin w AIM-V bez surowicy (Life Technologies Inc.). Komórki następnie zebrano, przemyto w PBS i stosowano w testach cytotoksyczności, jak opisano poniżej. Całkowite przygotowanie RNA i synteza cDNA pierwszej nici. Całkowity RNA przygotowano z OVAC i Caov-4 przy użyciu RNA Bee zgodnie z protokołem producenta (TelTest Inc., Friendswood, Texas, USA). Następnie przeprowadzono syntezę pierwszej nici cDNA z zastosowaniem odwrotnej transkryptazy wirusa mysiej białaczki Moloney, jak opisano przez producenta (Life Technologies Inc.). Ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym. Przeprowadzono ilościową PCR w czasie rzeczywistym w celu ilościowej oceny ekspresji genu HLA-E przy użyciu systemu detekcji ABI Prism 7700 (Applied Biosystems, Foster City, California, USA), jak opisano wcześniej (28). W skrócie, startery zaprojektowano dla konserwatywnych regionów genu HLA-E w celu pokrycia detekcji wszystkich różnych alleli HLA-E.
[więcej w: sprzęt rehabilitacyjny dla dzieci, biustonosze na duzy biust, nefrolog dziecięcy wrocław ]
[więcej w: mozga kanaryjska gdzie kupić, nfz poznań piekary godziny otwarcia, sanatoria nad morzem nfz ]