Skip to content

Odpowiedzi limfocytów T CD8 + Multichpitope na szczepionkę peptydową NY-ESO-1 powodują nieprecyzyjne ukierunkowanie guza ad

1 miesiąc ago

715 words

Analizując odpowiedź na tę szczepionkę za pomocą fluorescencyjnych kompleksów multimerycznych A2 / peptyd, zawierających nakładające się peptydy wiążące A2 w regionie 157-167, wykryto heterogenną odpowiedź komórek T CD8 + skierowaną przeciwko kilku różnym zachodzącym na siebie epitopom zawartym w tym regionie. Jednakże, wśród komórek T CD8 + skierowanych na wiele komórek wywołanych przez szczepionkę, tylko te, które rozpoznają peptyd 157-165 o wystarczająco wysokiej awidności funkcjonalnej, rozpoznają naturalnie obrabiany cel na komórkach nowotworowych NY-ESO-1 +, podczas gdy inne zachodzące na siebie epitopy nie wydają się być skuteczne. być znacząco wyrażane przez komórki nowotworowe NY-ESO-1 +. Metody Pacjenci i protokół szczepień. Odpowiedź na szczepienie peptydami NY-ESO-1 analizowano u dwóch pacjentów z mięsakiem maziówkowym (LUD 24/1 i LUD 24/3) i jednego pacjenta z mięsakiem gładkokomórkowym (LUD 24/2). Trzech pacjentów wykazywało ekspresję A2 i miało zmiany ekspresjonujące NY-ESO-1 (3. Uzyskano świadomą zgodę na włączenie do protokołu immunizacji sponsorowanego przez Ludwig Institute for Cancer Research (LUD 00-024). Pacjentom immunizowano w odstępach 2-tygodniowych śródskórnie 100 .g peptydów NY-ESO-1 157-165 i 157-167 każdy w 300 .l 100% DMSO w oddzielnych miejscach przedramienia, przez 11 tygodni. GM-CSF (100 .g / dzień) podawano podskórnie jako adiuwant, codziennie, przez 5 dni, rozpoczynając 2 dni przed każdym zestawem zastrzyków peptydów. Multimery A2 / peptydowe i analiza immunofluorescencyjna cytometrii przepływowej. Związane z PE multimeryczne kompleksy A2 / peptydowe zawierające peptydy pochodne NY-ESO-1 (3 (Tabela 1) zsyntetyzowano zgodnie z opisem (13, 14). Próbki barwiono multimerem A2 / peptydem (4,5 .g / ml) w PBS zawierającym 0,2% BSA przez godzinę w temperaturze pokojowej, przemyto raz w tym samym buforze, wybarwiono mAb anty-CD8 (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, Kalifornia, USA) przez 20 minut w temperaturze 4 ° C, ponownie przemyto i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej (systemy immunocytometryczne Becton Dickinson). Analizę danych przeprowadzono za pomocą oprogramowania Cell Quest. Tabela Aktywność wiązania z HLA-A * 0201 peptydów NY-ESO-1 w komórkach regionu 157-167. Pacjenci. PBMC hodowano in vitro przez tydzień w pożywce CTL (15) zawierającej hIL-2 (10 IU / ml, Roche Pharma, Bazylea, Szwajcaria) i hrIL-7 (10 ng / ml; R & D Systems Europe Ltd., Abingdon, United Królestwo) w obecności peptydu 157-165 lub peptydu 157-167 (1 (M, dodanego w dniu 1). W celu zredukowania mostków dwusiarczkowych obecnych w roztworze peptydów, peptydy NY-ESO-1 inkubowano wstępnie przez godzinę w temperaturze pokojowej ze środkiem redukującym dwusiarczek Tris [2-karboksyetylo] fosfiny ([TCEP] 2 mM; Pierce Biotechnology, Rockford, Illinois , USA) (Weisan Chen, komunikacja osobista) przed użyciem do stymulacji pacjentów. PBMC lub przed testami funkcjonalnymi (patrz poniżej). W tym ostatnim przypadku TCEP dodawano następnie podczas testu przy końcowym stężeniu 500. M. Limfocyty A2 / peptyd multimer + CD8 + oczyszczono z PBMC ex vivo lub po stymulacji in vitro wskazanym peptydem przez sortowanie komórek cytometrii przepływowej i klonowano przez ograniczającą hodowlę rozcieńczeń w obecności PHA (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA), napromieniowane allogenicznie PBMC i hIL-2 jak opisano (15). Klony następnie ekspandowano przez okresową (3. 4 tygodnie) restymulację w tych samych warunkach. Testy wiązania A2 i wykrywania antygenu. Rozpoznanie antygenu oceniano za pomocą testu uwalniania chromu (test CTL). Ludzka zmutowana linia komórkowa A2 + CEMx721.T2 (T2, A2 + NY-ESO-1 .) (16) lub linie komórkowe czerniaka Me 275 (A2 + NY-ESO-1 +), NA8 (A2 + NY-ESO-1 .) , Me 260 (A2.) Zostały użyte jako cele. W skrócie, po znakowaniu 51Cr przez godzinę w 37 ° C, a następnie intensywnym przemywaniu, komórki docelowe (1,000 / studzienkę) inkubowano z komórkami efektorowymi we wskazanym stosunku komórek efektorowych do docelowych (E / T) przez 4 godziny w 37 ° C. ° C pod nieobecność lub w obecności wskazanego syntetycznego peptydu (1. M). W doświadczeniach z miareczkowaniem peptydów komórki docelowe inkubowano z efektorami w stosunku E / T wynoszącym 10: w obecności seryjnych rozcieńczeń wskazanego peptydu. Uwalnianie chromu mierzono w supernatancie hodowli stosując licznik (3. Procent specyficznej lizy obliczono jako 100 x ((eksperymentalne. Uwalnianie spontaniczne) / (całkowite. Uwolnienie spontaniczne)]. Wiązanie peptydu z A2 oceniano w funkcjonalnym teście kompetycyjnym opartym na hamowaniu rozpoznawania antygenowej peptydowej tyrozynazy 368-376 przez CTL specyficzny względem ograniczonego A2, jak opisano wcześniej (11). IFN-. Test ELISPOT (17) przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (11). Degradacja peptydów NY-ESO-1 w ludzkiej surowicy. Peptydy dodano do ludzkiej surowicy (wstępnie ogrzanej przez 10 minut w 37 ° C) do końcowego stężenia 0,5 x 10 ~ 4 M i inkubowano w 37 ° C
[patrz też: sanatoria nad morzem nfz, leclerc godziny otwarcia, nefrolog dziecięcy wrocław ]
[hasła pokrewne: sanatoria nad morzem nfz, prohormony skutki uboczne, łowisko mąkolno ]