Skip to content

Zmniejszenie dystrofii mięśniowej u myszy poprzez nadekspresję SERCA w mięśniach szkieletowych ad 8

1 miesiąc ago

601 words

Następnie 250 .l białka inkubowano w podłożu kalpainy przez godzinę w 37 ° C. Próbki odczytywano w trzech powtórzeniach w czytniku płytek wyposażonym w filtr wzbudzenia 400 nm i filtr emisji 505 nm. Zarówno pozytywne, jak i negatywne kontrole przeprowadzono zgodnie z sugestią producenta. Absorpcja EBD. Zwierzęta umieszczono w klatkach wyposażonych w kółka do biegania przez 5 dni dobrowolnego biegu (wszystkie myszy miały równe obroty dziennie). Piątego dnia myszom wstrzyknięto EBD (10 mg / ml, 0,1 ml / 10 g masy ciała) i pozostawiono do uruchomienia przez 48 dodatkowych godzin. Następnie myszy uśmiercono, a mięsień czworogłowy, TA, przeponę, płaszcz i brzuchaty łydki osadzono w OCT i szybko zamrożono w ciekłym azocie do oglądania, jak opisano wcześniej (14). SR Ca2 + wychwyt. Trzy miesięczne myszy uśmiercono, a mięsień czworogłowy usunięto chirurgicznie i natychmiast homogenizowano w 50 mM KH2PO4 (pH 7,0), 10 mM NaF, mM EDTA, 0,3 M sacharoza, 0,3 mM fluorku fenylometylosulfonylu i 0,5 mM ditiotreitolu. Pobór Ca45 w homogenatach mięśni (0,1 mg / ml) mierzono za pomocą modyfikacji techniki filtracji Millipore, jak opisano wcześniej (46). Wskaźniki wychwytu Ca2 + obliczono za pomocą analizy regresji liniowej metodą najmniejszych kwadratów przy 30-, 60- i 90-sekundowych wartościach wychwytu Ca2 +. Dane analizowano za pomocą nieliniowej regresji przy użyciu oprogramowania ORIGIN (wersja 6.0). Pomiar stanów nieustalonych Ca2 +. Włókna FDB wyizolowano jak opisano uprzednio (47) i zrównoważono w normalnym roztworze Ringera (140 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM CaCl2, mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH do 7,4) przez około 15 minut. Włókna były obciążone 5. M Fura-2 AM przez inkubację w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Transgeny Ca2 + wywołano poprzez stymulację polową z użyciem elektrod platynowych przy częstotliwości stymulacji 0,2 Hz. Rejestrowano szczyt wywołanego elektrycznie przejściowego Ca2 +. Fazę rozpadu przejściowego Ca2 + analizowano jako parametr wychwytu zwrotnego Ca2 + z cytozolu. Współczynnik wzbudzenia Fura 2-AM (340/380 nm) zarejestrowano na odwróconym mikroskopie Nikon Ti-U wyposażonym w fotopowielacz z Photon Technology Inc. Zastosowano lokalnie nałożony bolus 500. M 4-CMC do oceny wrażliwego na RyR SR Ca2 + ładunek na końcu pociągu elektrycznych stanów przejściowych Ca2 +. Szczytową odpowiedź 4-CMC analizowano w celu określenia obciążenia Ca2 + SR. Wymuszona bieżnia działa. Trzy-miesięczne myszy umieszczono na indywidualnych torach elektrycznie napędzanej bieżni z 4 torami (Omni-Pacer LC4 / M, Columbus Instruments International) z prędkością 6 m / min przez 3 minuty. Bieżnia miała 19 cali szerokości i 20 cali długości, z przenośnikiem taśmowym do poruszania się pasów o szerokości 3 cali i długości 12 cali. Schemat treningowy został po raz pierwszy ustanowiony na 10 minut, aby zapoznać się z otoczeniem i siatkami amortyzującymi ustawionymi w zakresie od 0 do 2,0 mA. Prędkość zwiększano z przyrostem 2 m / min co 3 minuty do maksymalnej prędkości 18 m / min. Wyczerpanie zostało ocenione jako więcej niż 5 kolejnych sekund na siatce uderzeniowej bez próby przywrócenia bieżni. Czas spędzony na bieżni przed wyczerpaniem lub czas wykonania protokołu został zapisany jako średni maksymalny czas spędzony na ćwiczeniach. Schemat bieżni został wykonany z płaskiej pozycji (bez nachylenia lub spadku). Produkcja i wtrysk AAV9. AAV9-CMV-GFP i AAV9-CMV-SERCA2a wytworzono stosując protokół 2-plazmidowy i hodowano w potrójnych kolbach przez 24 godziny (DMEM, 10% FBS) przed dodaniem osadu fosforanu wapnia (48). Po 72 godzinach wirus oczyszczono z surowych lizatów komórek potraktowanych benzonazą na gradiencie gęstości jodiksanolu (OptiPrep, Greiner Bio-One Inc.), a następnie chromatografii powinowactwa na heparynie-agarozie typu I (Sigma-Aldrich). Na koniec, wirusy zatężono i sformułowano w roztworze Ringera z dodatkiem mleczanu (Baxter Healthcare Corp.) przy użyciu koncentratorów wirówkowych Vivaspin 20 50K MWCO (Vivascience Inc.) i przechowywano w temperaturze <80 ° C. AAV9-SERCA2a i AAV9-GFP wstrzyknięto, odpowiednio, lewej i prawej łydce, 3-dniowej Sgcd A / l. myszy, w ilości około 1010 cząstek wirusa. Myszy uśmiercono po 6 tygodniach i brzuchatego łydki z obu stron poddano obróbce, zatopiono, podzielono i zabarwiono H & E lub wytworzono kriosekcję do oceny fluorescencji GFP. Statystyka. Wszystkie wyniki są przedstawione jako średnie. SEM. Analizę statystyczną przeprowadzono z niesparowanym t-tailowym testem t (dla 2 grup) i jednoczynnikową ANOVA z poprawką Bonferroniego (dla grup 3 lub więcej). Wartości P mniejsze niż 0,05 uznano za znaczące. Materiały uzupełniające Zobacz Uzupełniające dane Podziękowania Tę pracę wspierali dotacje od NIH (do JD Molkentin, RJ Hajjar i EG Kranias). JD Molkentin był również wspierany przez stypendia Fundacji Jain i Howard Hughes Medical Institute. SA Goonasekera wspierała lokalna filia American Heart Association. Przypisy Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J Clin Invest. 2011; 121 (3): 1044-1052. doi: 10.1172 / JCI43844. [przypisy: mozga kanaryjska gdzie kupić, lowisko zgoda, u bogdana ] [hasła pokrewne: mozga kanaryjska gdzie kupić, nfz poznań piekary godziny otwarcia, sanatoria nad morzem nfz ]