Skip to content

Inhibitor szlaku czynnika tkankowego-2 jest nowym inhibitorem metaloproteinaz macierzy zewnątrzmacicznej mającym wpływ na miażdżycę ad

1 miesiąc ago

695 words

Tak więc, działanie mechanizmów hamujących poza TIMPs jest postulowane w przypadkach miażdżycy, chociaż prosta korelacja ilościowa MMP z TIMP prawdopodobnie nie odzwierciedla w wystarczającym stopniu złożonych sytuacji in vivo (np. Lokalne stężenia enzymów degradujących macierz i ich inhibitory mogą się różnić z powodu kompartmentalizacji; patrz ref. 30. 32). Co ciekawe, poprzednia praca z kilku grup dotyczyła członków nadrodziny serpin, tj. P 2-makroglobuliny i RECK, w regulacji aktywności MMP (33. 35). Zgodnie z jego znaczącą lokalizacją ECM (4), poprzednie doniesienia sugerują funkcję ochronną macierzy dla Serpin TFPI-2. TFPI-2 hamował degradację macierzy i inwazję komórek włókniakomięsaka (36). Rao i in. wykazali, że stężenie TFPI-2 w sposób zależny hamowało aktywację pro. MMP-1 zależną od plazmin i pro. MMP-3, chociaż nie było jasne, czy zaszło hamowanie z powodu wiązania z plazminą lub z MMP (5). Postawiliśmy hipotezę, że TFPI-2 może działać bezpośrednio jako endogenny inhibitor aktywnych MMP i że lokalny niedobór TFPI-2 może odnosić się do ludzkiego miażdżycy. Metody Materiały. Królicze anty-ludzkie TFPI-2 Ab przygotowano jak opisano wcześniej (1). Rekombinowany ludzki TFPI-2 eksprymowano w komórkach nerki chomika transfekowanych cDNA TFPI-2 i oczyszczono z pozbawionego surowicy kondycjonowanego podłoża przez połączenie chromatografii na heparynie-agarozie, Mono Q FPLC, Mono S FPLC i Superose 12 FPLC (wszystko z Amersham). Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, New Jersey, USA). Oczyszczone TFPI-2 migrowało jako pojedyncze pasmo o pozornej masie cząsteczkowej 32 kDa w SDS-PAGE w warunkach redukujących (dezaktywowanych termicznie) i nieredukujących (nie poddanych obróbce cieplnej) (Figura 1h). N-końcowa sekwencja rekombinowanego TFPI-2 była identyczna z sekwencją przewidywaną z cDNA. Ludzka rekombinowana IL-1A i TNF-a otrzymano z Endogen Inc. (Cambridge, Massachusetts, USA), a rekombinowany TIMP-1 zakupiono od Calbiochem-Novabiochem Corp. (La Jolla, Kalifornia, USA). Ludzką rekombinowaną CD40L wytworzono jak opisano wcześniej (37). Endotoksynę Escherichia coli (LPS) zakupiono w firmie Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA). Zymogen MMP-2 zakupiono w Oncogene Research Products (San Diego, Kalifornia, USA). Poliklonalne królicze anty-ludzkie MMP-1, -2 i -9 (Triple Point Biologics Inc., Portland, Oregon, USA), jak również mysie antyludzkie MMP-13 (uprzejmie dostarczone przez Carlosa Lopeza-Otina, University of Oviedo , Oviedo, Hiszpania) zostały użyte do analizy immunohistochemicznej i analizy Western blot. Monoklonalne mysie anty-ludzkie TIMP-1 i TIMP-2 otrzymano z Calbiochem-Novabiochem Corp. Ludzką rekombinowaną katepsynę S i katepsynę K dostarczono z przyjemnością przez Guo Ping-Shi (University of California, San Francisco, California, USA). Figura Ludzki rekombinowany TFPI-2 (recTFPI-2) hamuje aktywność MMP. Ludzkie rekombinowane MMP-1 (a, e), MMP-13 (b, f), MMP-2 (c), MMP-9 (d) i katepsyna S lub K (g) (wszystkie w ilości 10 ug / ml ) inkubowano z odpowiednimi stężeniami TFPI-2 (a-d, g) lub TIMP-1 (e, f) (1 godzina, 37 ° C) i zdolnością enzymów do przetwarzania natywnego sprzężonego z fluoroforem (a , b, e, f) lub substratu peptydowego (c, d, g) mierzono zgodnie z opisem. Procent aktywności znormalizowano do aktywności uzyskanej za pomocą odpowiedniej MMP pozbawionej TFPI-2. Przedstawione dane reprezentują średnią. SD i są reprezentatywne dla co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. (h) Ludzki rekombinowany TFPI-2 (10 .g / ścieżkę), wyrażony i oczyszczony, jak opisano w Methods, zastosowano do analizy 15% SDS-PAGE w warunkach redukujących (Red.) i nieredukujących (Non-Red.). Białka wizualizowano przez barwienie srebrem. Pozycje znaczników masy cząsteczkowej zaznaczono po lewej stronie. Test aktywności MMP. Testy aktywności MMP i katepsyny wykorzystywały oczyszczony trójleżowy helikalny kolagen typu I (Chemicon International, Temecula, California, USA) lub samowznoszące się fluoroforowe substraty natywne lub syntetyczne (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA; Chondrex LLC , Redmond, Washington, USA lub Chemicon International). Analiza aktywności MMP-1 i MMP-13 (zarówno 10 .g / ml, dostarczonych odpowiednio jako obcięte formy 41/44-kDa i 27-kDa, Chemicon International) wymagała aktywacji poprzez mM octan p-aminofenylortęci (APMA) dla 2 godziny. MMP-2 i MMP-9 (oba 10 .g / ml, Oncogene Research Products) dostarczono jako dojrzałe, aktywne enzymy (odpowiednio 66 kDa i 83 kDa). W celu analizy hamowania, MMP preinkubowano z odpowiednimi stężeniami TFPI-2 przez godzinę w 37 ° C w buforze reakcyjnym (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, | 3M chlorku cynku, 0,01 % vol / vol BRIJ 35)
[podobne: herbata czarna właściwości, łowisko u roberta, biedronka świątniki górne ]
[patrz też: łowisko u roberta, u bogdana, lowisko zgoda ]