Skip to content

Inhibitor szlaku czynnika tkankowego-2 jest nowym inhibitorem metaloproteinaz macierzy zewnątrzmacicznej mającym wpływ na miażdżycę ad 6

1 miesiąc ago

733 words

Rzeczywiście, współstrącana aktywność żelatynowa anty-TFPI-2 o pozornej masie cząsteczkowej 72 kDa i 92 kDa, odpowiadająca spodziewanej masie cząsteczkowej MMP-2 i MMP-9, wykazująca interakcje białko-białko między TFPI-2 i MMP (rysunek 4a). Kontrola nie IgG królika IgG nie koprecypituje aktywności żelatynolitycznej, wykazując swoistość stosowanego Ab (Figura 4a). Ponadto, anty-TFPI-2 koprecypitował zymogen MMP-2 (Figura 4b), jak również dojrzałe formy śródmiąższowej kolagenazy MMP-1 i MMP-13 (Figura 4c) po koinkubacji bez komórek in vitro rekombinowanego TFPI-2. z odpowiednią rekombinowaną MMP, wykazując bezpośrednią interakcję pomiędzy enzymem i inhibitorem. Eksperymenty kontrolne wykazały, że termoaktywowany (10 minut, 95 ° C) TFPI-2 utracił zdolność oddziaływania z testowanymi MMP. Ponadto, anty-TFPI-2 nie wytrącało ani MMP bezpośrednio, ani poprzez TFPI-1 (Figura 4, b i c). Figura 4Anti . TFPI-2 koprecypituje MMP-1, MMP-2, MMP-9 i MMP-13. (a) Supernatanty niestymulowanych (brak), stymulowanych IL-1 (3 / TNF-a (10/50 ng / ml) lub stymulowanych CD40L (10 ug / ml) ludzkich naczyniowych SMC immunoprecypitowano anty-TFPI- 2 (TFPI-2) lub króliczą Ig (rb Ig) i osady, jak również oryginalne supernatanty hodowli (SN) analizowano metodą zymografii SDS-PAGE. Przezroczyste obszary wskazują na żelatynizol. Porównywalne dane uzyskano przy użyciu SMC od trzech różnych dawców. (b) Rekombinowany prekursor MMP-2, jak również (c) aktywny MMP-1 (na górze) i MMP-13 (na dole) (wszystkie 10 .g / ml) inkubowano (1 godzina, 37 ° C) z rekombinowanym TFPI- 2 (50 .g / ml). Reakcje immunoprecypitowano za pomocą anty-TFPI-2 i analizowano metodą Western blotting dla odpowiedniej MMP. Do celów kontrolnych stosowano rekombinowany rekombinowany TFPI-2 (np. RecTFPI-2), rekombinowany TFPI-1 (50 .g / ml) lub TFPI-1. Pozycje znaczników masy cząsteczkowej zaznaczono po lewej stronie. TFPI-2 kolokalizuje z SMC, ale nie Ms, w zmianach miażdżycowych in situ. Zgodnie z różnicową regulacją in vitro ekspresji TFPI-2 w SMC i Ms, komórki uważane za głównych producentów MMP w obrębie ludzkiego miażdżycy, obserwowaliśmy również zróżnicowaną ekspresję tego endogennego inhibitora w tych typach komórek w zmianach miażdżycowych in situ. Analiza immunohistochemiczna wykazała, że TFPI-2 kolokalizuje z SMC zarówno w pożywce tunica normalnych tętnic, jak i po mediach pod włóknistą nasadką pokrywającą zmiany miażdżycowe (Figura 5, aib). Barwienie inhibitora w SMC w chorej tkance wydawało się bardziej intensywne niż barwienie w mediach nie miażdżycowych (dane nie pokazane). W przeciwieństwie do tego obszary wzbogacone w M (takie jak obszar barku płytki nazębnej, zabarwione słabo, jeśli w ogóle, na TFPI-2 (Figura 5c). TFPI-2 jest następnie kolokalizowany za pomocą ECs, ustalonego źródła tego inhibitora typu Kunitza (4), z mikronaczyniowym EC wykazującym szczególnie intensywne zabarwienie (dane nie pokazane). Figura 5SMC i M. S różnicowo wyrażają TFPI-2 w ludzkiej miażdżycy. Odcinki kriostatu od niedrożnej aorty (normalnej) i miażdżycowej tętnicy szyjnej tętnicy szyjnej (Athero) barwiono na SMC i M, stosując odpowiednio (a, b) anty-aktynę i (c) y-CD68 (lewe panele). Lokalizację TFPI-2 (prawe panele) pokazano za pomocą mikroskopii świetlnej (a, c) w sąsiednich sekcjach lub (b) podwójne znakowanie immunofluorescencyjne dla bezpośredniej kolokalizacji w tej samej sekcji (barwienie (3-aktyny dla SMC na czerwono; TFPI-2 barwienie na zielono). Analiza próbek chirurgicznych uzyskanych od czterech różnych dawców wykazała podobne wyniki. Ponieważ TFPI-2 koprecypitowano z MMP in vitro (Figura 4), dalej badaliśmy, czy MMP i TFPI-2 kolokalizują in situ. Chociaż MMP-2 (Figura 6a) i MMP-9 (Figura 6b) kolokalizowano za pomocą TFPI-2, proteinazy zlokalizowane były głównie w regionie ramienia wzmacnianego M (3, podczas gdy TFPI-2 głównie umiejscowiony w włóknistej czapce wzbogaconej w SMC uszkodzenie, jak określono przez dwukrotne barwienie immunofluorescencyjne (Figura 6c). Podobnie jak w przypadku żelatynaz, immunoreaktywny MMP-1 (czerwony, Figura 6d) i MMP-13 (czerwony, Figura 6e) przewyższał poziomy TFPI-2 (zielony) w zmodyfikowanym obszarze M (str.1) uszkodzenia (prawe panele), w kontrastuje z widoczną obecnością inhibitora w włóknistej czapce wzbogaconej w SMC (lewe panele). Odkrycia te demonstrują różnicową ekspresję TFPI-2 i MMP w ludzkich zmianach miażdżycowych, z inhibitorem dominującym w włóknistej czapce i rzadkim w obszarach związanych z niestabilnością płytki nazębnej i pęknięciem, chociaż analiza immunohistochemiczna nie pozwala na ścisłe oznaczenie ilościowe. Odkrycie to ma szczególnie ważne implikacje w odniesieniu do aktywności MMP-1 i MMP-13, enzymów, które niedawno zaangażowaliśmy w kolagenolizę w obrębie ludzkiego miażdżycy (9). Figura 6 Ekspresja TFPI-2 jest zmniejszona w okolicy barku ludzkich blaszek miażdżycowych
[hasła pokrewne: u bogdana, biustonosze na duzy biust, dieta montignaca przepisy ]
[więcej w: nefrolog dziecięcy wrocław, dieta montignaca przepisy, ciśnienie atmosferyczne a samopoczucie ]