Skip to content

Inhibitor szlaku czynnika tkankowego-2 jest nowym inhibitorem metaloproteinaz macierzy zewnątrzmacicznej mającym wpływ na miażdżycę ad 5

1 miesiąc ago

773 words

W celu określenia specyficzności inhibicji, w której pośredniczy TFPI-2, katepsyny S i K zastosowano do testów przetwarzania identycznych z tymi stosowanymi dla MMP, ale stosując elastynę jako natywne podłoże. TFPI-2 nie wpływał na aktywność elastolityczną katepsyny, nawet przy stężeniach tak wysokich jak 50 000 ng / ml (Figura 1g). W celu dalszego zbadania zdolności TFPI-2 do zmniejszania kolagenoli, degradację trójleżkowego kolagenu typu I przez MMP-1 lub MMP-13 preinkubowane z lub bez serpiny analizowano metodą Western blotting. Traktowanie kolagenu śródmiąższowego za pomocą tych MMP dało oczekiwany produkt cięcia o długości trzech czwartych długości i utratę immunoreaktywnego kolagenu typu I o pełnej długości. Podobnie jak w testach fluorogennych, stężenie TFPI-2 w sposób zależny hamowało odszczepienie kolagenu typu I przez obie śródmiąższowe kolagenazy (Figura 2). Jak już wykazano w testach fluorogennych, TFPI-2 hamował obie kolagenazy o stechiometrii podobnej do TIMP-1 (Figura 2, aib). Co ciekawe, preinkubowanie TFPI-2 z VIIa / TF (Figura 2) lub z trypsyną (dane nie pokazane), nie zmniejszyło zdolności hamowania serpin w stosunku do MMP-1 lub MMP-13 w oczyszczonym (Figura 2c) lub fluorogennym. (Figura 2d) test kolagenu typu I, co wskazuje, że hamowanie MMP i proteinaz serynowych wykorzystuje różne domeny TFPI-2. Figura 2TFPI-2 hamuje przetwarzanie kolagenu trój-helikalnego typu I (Col I) przez śródmiąższowe kolagenazy. Oczyszczony ludzki potrójnie helikalny kolagen typu I (100 ug / ml) inkubowano (24 godziny, 25 ° C) z albo MMP-1 (a), albo MMP-13 (b) (oba przy 10 ug / ml) preinkubowanych przy odpowiednim stężeniu TFPI-2 lub TIMP-1 lub (c) inkubowane z MMP-1 i MMP-13 (obie przy stężeniu 10 .g / ml) preinkubowane z TFPI-2 (100 .g / ml) skompleksowane (45 minuty, 37 ° C) z VIIa / TF (20 nM). Reakcje zostały zastosowane do analizy Western blot za pomocą kolagenu Ab typu I. (d) Ludzką rekombinowaną MMP-1 lub MMP-13 (obie po 10 .g / ml) inkubowano z TFPI-2 (100 .g / ml) skompleksowanymi z odpowiednimi stężeniami związku VIIa / TF i kolejną zdolnością MMP do przetwarzania natywnego fluorogennego substratu mierzono zgodnie z opisem. Procent aktywności znormalizowano do aktywności uzyskanej za pomocą odpowiedniej MMP pozbawionej TFPI-2. Przedstawione dane reprezentują średnią. SD i są reprezentatywne dla co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. Ludzkie naczyniowe SMC i Ms wykazują różnicową ekspresję TFPI-2 in vitro. Dalsze eksperymenty analizowały ekspresję TFPI-2 przez SMC i Ms, ustalone źródła MMP w ludzkiej miażdżycy. Hodowane ludzkie naczyniowe SMC wyrażały konstytutywnie związany z komórką TFPI-2 (Figura 3, góra), przy czym większość inhibitora lokalizowała się w ECM (dane nie pokazane), jak wcześniej zgłoszono dla EC (4). Stymulacja za pomocą zapalnych cytokin IL-1. i TNF-a Koncentracja i czas w zależności zwiększały konstytutywną komórkową ekspresję TFPI-2, a ponadto indukowały uwalnianie inhibitora. W przeciwieństwie do tego, inny silny agonista ekspresji MMP w SMC, CD40L, nie indukował znacząco żadnego związanego z komórką TFPI-2 lub uwalniania inhibitora, nawet w stężeniach do 10 .g / ml (Figura 3, góra). Żaden z tych bodźców nie wpłynął na liczbę komórek ani ich żywotność (dane nie pokazane). Figura 3D-ekspresyjna ekspresja TFPI-2 w hodowanych SMC i Ms. (a) Ludzkie naczyniowe SMC hodowano w pożywce IT (24 godziny) i albo stymulowano przez 24 godziny z odpowiednimi stężeniami IL-1 (3 / TNF-a. (po lewej) lub stymulowane przez wskazany czas za pomocą 10/50 ng / ml IL-1 p / TNF-a. (środkowy) lub 10 .g / ml CD40L (po prawej). (b) Jednojądrzaste fagocyty (M.) hodowano przez 0, 1, 3 lub 11 dni w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej 5% ludzką surowicą. Przed (24 godzin) stymulacją LPS (100 ng / ml) komórki hodowano w pożywce wolnej od surowicy. SMC i M. lizaty hodowlane (30 .g / ścieżkę) i supernatanty SMC (SN) zastosowano do analizy metodą Western blot z zastosowaniem. TFPI-2. Pozycje znaczników masy cząsteczkowej zaznaczono po lewej stronie. Porównywalne dane uzyskano wykorzystując komórki od czterech różnych dawców. Ponieważ Ms prawdopodobnie stanowią główne źródło MMP w ludzkim ciele miażdżycowym, zbadaliśmy również ekspresję TFPI-2 przez ten typ komórek. Stymulacja IL-la, TNF-a, CD40L (dane nie pokazane) lub LPS (Figura 3b) nie wpływała zasadniczo na konstytutywną ekspresję TFPI-2 w świeżo wyizolowanych jednojądrzastych fagocytach krwi obwodowej. Hodowla tych komórek przez 3 dni zmniejszała ekspresję immunoreaktywnego TFPI-2, który stał się niewykrywalny po przedłużonej hodowli. Zatem regulacja tego endogennego inhibitora odwrotnie koreluje z ekspresją śródmiąższowych kolagenaz MMP-1 i MMP-13 podczas M. zróżnicowanie, zgodnie z wcześniejszą publikacją (9). Aby zbadać potencjalne mechanizmy zahamowania aktywności MMP za pośrednictwem TFPI-3, supernatanty hodowli SMC poddano immunoprecypitacji z użyciem anty-TFPI-2 Ab.
[przypisy: biedronka świątniki górne, biustonosze na duzy biust, prohormony skutki uboczne ]
[patrz też: zatańcz ze mną cda, leclerc godziny otwarcia, jak naturalnie rozjaśnić włosy ]